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目的:建立一种能特异性鉴别卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫及三平正并殖吸虫囊蚴的荧光定量PCR方法,并将该方法在我国4省并殖吸虫病流行区进行初步评价。方法:1、通过GenB ank TM下载卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的CO1序列进行比对分析,设计了3对特异性引物和探针,可特异性的鉴别上述三种并殖吸虫。2、对三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR引物浓度、探针浓度和退火温度进行优化,分别建立了卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR鉴定检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。3、使用与单重荧光定量PCR方法相同的引物和探针,并对其浓度进行优化,建立同时鉴别检测卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的多重荧光定量PCR检测方法,并进行特异性实验、灵敏度实验和建立了相应的标准曲线。4、采集来自安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡及漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴,提取囊蚴DNA后,使用常规PCR方法和多重荧光定量PCR方法同时分类鉴定采集的囊蚴样本,评估多重荧光定量PCR方法的分类鉴定能力。结果:1、构建的阳性质粒分别与GenBankTM中发表的卫氏并殖吸虫(AY140692.1)、斯氏并殖吸虫(AY618798.1)、三平正并殖吸虫(AF159594.1)序列相似性分别为99.65%、98.17%、98.85%。2、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法仅对目的基因有扩增曲线,对其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR检测的DNA最低浓度分别达到卫氏并殖吸虫30.5 copies/μL、斯氏并殖吸虫32.1 copies/μL、三平正并殖吸虫0.322 copies/μL。单重荧光定量PCR扩增效率、扩增曲线方程式及相关系数分别为:卫氏并殖吸虫E=96.6%、Y=-6.8128x+37.059、R2=0.9998;斯氏并殖吸虫 E=91.8%、Y=-7.0721x+45.106、R2=0.9997;三平正并殖吸虫E=105.40%、Y=-6.3993x+33.957、R2=0.9995。可见本研究建立的三种并殖吸虫的单重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。3、本研究建立的多重荧光定量PCR方法能同时特异性扩增卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫的目的基因片段,而其他寄生虫无特异性扩增。在灵敏度试验中,多重荧光定量PCR方法检测到的最低浓度为:卫氏并殖吸虫3.05×102 copies/μL、斯氏并殖吸虫 3.21×103 copies/μL、三平正并殖吸虫3.22×102 copies/μL。多重荧光定量PCR方法建立的相关系数、扩增效率及标准曲线方程分别为:卫氏并殖吸虫R2=0.9984,E=85.8%,Y=-3.7082x+27.501;斯氏并殖吸虫R2=0.9974,E=97.5%,Y=-3.3715x+33.68;三平正并殖吸虫 R2=0.9938,E=93.0%,Y=-3.5608x+18.874。因此,本研究建立的多重荧光定量PCR方法满足荧光定量的基本参数,且具有较高的特异性和灵敏度。4、多重荧光定量PCR方法鉴定5个调查点的样本结果分析显示:安徽省休宁县蓝田镇和浙江省永嘉县陡门乡的并殖吸虫囊蚴DNA在FAM通道(465-510)显示阳性结果(图2.4 A),而其他均为阴性;河南省济源市邵原镇和福建省政和县岭腰乡的并殖吸虫囊蚴DNA在VIC通道(533-580)显示阳性结果(图2.4 B),而其他均为阴性;福建省漳州市南靖县和溪镇的并殖吸虫囊蚴DNA在CY5通道(618-660)显示阳性结果(图2.4 C),而其他均为阴性。结果表明多重荧光定量PCR方法鉴定安徽省休宁县和浙江省永嘉县的并殖吸虫囊蚴为卫氏并殖吸虫,河南省济源市和福建省政和县的并殖吸虫囊蚴为斯氏并殖吸虫,福建省漳州市的并殖吸虫囊蚴为三平正并殖吸虫。5、采用多重荧光定量PCR方法与常规PCR后测序方法同时分类鉴定65份囊蚴样本。结果显示,多重荧光定量PCR方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为100%(65/65),而常规PCR后测序方法对采集的并殖吸虫囊蚴样本的分类鉴定率为72.31%(47/65),常规PCR方法中显示阳性的结果在多重荧光定量PCR方法中均显示阳性,显示阴性的结果经加量测序分析或形态学鉴定,鉴定结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致。该结果表明多重荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度和特异性。6、安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县陡门乡、河南省济源市邵原镇、福建省政和县岭腰乡、福建省漳州市南靖县和溪镇5个调查点的溪蟹阳性率分别为82%(49/60)、41%(29/70)、55%(41/74)、65%(41/63)和 45%(32/71)。经形态学鉴定,5个地区的并殖吸虫囊蚴虫种分别为卫氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫。经常规PCR后分子鉴定分析:安徽省和浙江省两地区采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2、CO1 基因(KC417492.1,AF219379.2)相似性最高,分别为 99%～100%、96%～99%,均与卫氏并殖吸虫聚为一支;河南省采集的并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2、CO1基因(KX129924.1,MK568551.1)相似性最高,分别为98%～100%、95%～99%,均与斯氏并殖吸虫聚为一支;福建政和县采集的并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与斯氏并殖吸虫ITS2基因(KX129924.1)的相似性最高,为98%～100%,与斯氏并殖吸虫、宫崎并殖吸虫聚为一大支(两虫种分支不明显),CO1基因序列与宫崎并殖吸虫CO1基因(AY618823.1,AY618834.1)相似性最高,为91%～94%,与宫崎并殖吸虫聚为一小支,而与斯氏并殖吸虫聚为一大支(两虫种分支较为明显);福建省漳州市南靖县和溪镇溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与卫氏并殖吸虫ITS2基因(KC417492.1)的相似性最高,达100%,CO1基因序列与三平正并殖吸虫CO1基因(AF159595.1)的相似性最高,为97%～99%,ITS2、CO1序列均与三平正并殖吸虫聚为一支。此结果表明无论是形态学鉴定,还是分子序列分析鉴定,结果均与多重荧光定量PCR方法鉴定结果一致,进一步证明了多重荧光定量PCR方法的高灵敏性和强特异性。结论:本研究建立的多重荧光定量PCR方法能够对溪蟹中并殖吸虫囊蚴样本进行快速鉴别。此方法的建立对并殖吸虫的分类研究提供了技术支持,开辟了并殖吸虫囊拗鉴定检测方法的新路径,对并殖吸虫的分类、地理分布、流行病学调查、食品安全、检疫具有重要应用价值。