副溶血弧菌是一种嗜盐、革兰阴性菌,广泛分布在水体、水底沉积物、水生生物体内,在全球频繁地引起食物中毒,多发生在夏季的沿海地区,是全球食源性疾病的重要病原体。近年来由于副溶血弧菌引起的食物中毒发生率逐年增长。副溶血弧菌的主要致病因子是耐热溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)。副溶血弧菌感染主要可以引起胃肠炎及伤口感染,罕见情况下可以导致败血症,副溶血弧菌导致的胃肠炎是重要的公共卫生事件,而副溶血弧菌的快速检测则是处置这些公共卫生事件的前提。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是存在于古生菌和细菌中的一种获得性免疫系统,在细菌和古生菌防止外来病原体入侵中发挥重要作用。CRISPR免疫功能中所涉及的对特异性核酸片段进行识别并且酶切的功能在病原体检测中发挥了作用。CRISPR 检测体系发挥作用需要 Cas(crispr associate protein),gRNA(guide RNA)和靶标序列(target)。本研究的目的是建立基于CRISPR/Cas的副溶血弧菌快速检测方法,包括Cas蛋白的提取和纯化,gRNA的设计和提取以及荧光显色系统的设计和检测。本研究选择使用Cas12a蛋白,首先通过在NCBI搜索获得Cas12a蛋白的表达序列,将其合成并构建到表达载体上,转入感受态细胞中在适宜条件下表达,然后提取纯化。第二部分是对gRNA的设计获得,通过已有的副溶血弧菌的特异性基因tdh、trh以及弧菌特异性基因toxR的比对分析,挑选出其中最保守的、最特异且长度在20-30 bp左右的序列,结合Cas12a需要特异性识别PAM(prospaceradjacent motif),即5’-TTTA-3’,将序列构建到载体上进行体外转录后提取gRNA。最后一部分是将显色基团FAM和淬灭基团BHQ Ⅰ连接在单链DNA的两端,当有副溶血弧菌存在时,CRISPR-VP系统在剪切靶标序列的同时也会将荧光显色系统的单链DNA切断,释放出荧光信号,使其对副溶血弧菌的检测具有更直观的结果。实验中将各组分按照比例配好CRISPR-VP反应体系,利用罗氏荧光PCR仪在37℃恒温条件下进行荧光信号的检测,通过荧光值以及荧光曲线实现对副溶血弧菌的鉴定。本研究初步建立的CRISPR-VP检测方法是基于CRISPR系统特异性剪切原理,使得该方法具有高特异性和灵敏性,同时荧光显色系统的应用使得在结果的判定上更加直观,克服传统检测中人为误差的存在,使检测结果更加准确。