实验目的：　　 肝癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤。肝癌的致死率在癌症引起的死亡中占第3位,肝癌的预后主要取决于是否有转移和术后复发。因而抗肝癌的侵袭转移,减少术后复发成为当今肝癌防治领域研究的热点。　　 恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、多环节的过程,包括粘附、迁移、细胞外基质或基底膜的降解等步骤。基质金属蛋白酶(matrix metallo proteina ses,MMPs)因能水解细胞外基质,促进肿瘤的转移而引起人们的广泛重视,其中MMP-9的过度表达与肝癌的侵袭转移密切相关。MMP-9的表达可以被很多刺激因素诱导表达,这些刺激因素包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等。在这些刺激因素中,TPA广泛被用来诱导MMP-9的表达。TPA是蛋白激酶C(PKC)的选择性激活剂,PKC激活后,通过MAPK(ERK、JNK、p38)以及PI3K/Akt通路调节转录因子NK-κB和AP-1的活性,进而调节MMP-9的基因表达。有多项研究证实,抑制MMP-9的活性,可以预防肿瘤的侵袭转移。因此,寻找有效的药物,抑制肿瘤的侵袭和转移是目前抗肿瘤研究的方向之一。　　 葫芦素B(cucurbitacinB)是从葫芦科植物中提取的一类高度氧化的四环三萜类化合物,研究表明它具有抗肿瘤、抗化学致癌和抗炎等多种生物活性。体内外研究表明,葫芦素B能够抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,对于多种人类肿瘤细胞有较强的生长抑制作用。本实验室对葫芦素B的抗癌作用也做了大量的研究,发现葫芦素B在体内外对乳腺癌、喉癌、胰腺癌及肝癌都有很好的抑制作用。但是这些作用都是基于对葫芦素B的抗增殖和诱导细胞凋亡等机制的研究,关于葫芦素B的抗侵袭和转移作用的研究还未见报道。本实验主要致力于葫芦素B对肝癌细胞侵袭和转移是否有抑制作用及其机制的研究。　　 材料和方法：　　 肝癌细胞系HepG2和BEL7402传代培养。MTT法检测并计算葫芦素B对肝癌细胞的增殖抑制率;不同浓度的葫芦素B作用于肝癌细胞系通过EMT和MET实验,以及软琼脂克隆实验观察葫芦素B对TPA作用后的肝癌细胞粘附作用的影响;通过划痕实验,transwell实验观察葫芦素B对肝癌细胞侵袭转移的抑制作用;通过明胶酶谱和westernblot检测葫芦素B对TPA诱导的肝癌细胞MMP-9表达的影响。通过westernblot方法检测MAPK(ERK1/2,P38,JNK),Akt,NF-gB,C-Fos,C-Jun等蛋白的表达的影响,探讨葫芦素B抑制TPA诱导的肝癌细胞MMP-9表达可能的作用机制。　　 结果：　　 1、不同浓度的葫芦素B和TPA作用于HepG2和BEL7402细胞,MTT实验结果显示:200nMTPA和葫芦素B在浓度低于1μM时,对两种细胞系的增殖率影响很小。软琼脂克隆形成:TPA能促进HepG2细胞的克隆形成,葫芦素B能显著抑制TPA诱导的克隆形成。EMT结果显示:TPA作用于贴壁后的HepG2细胞,显微镜下看到细胞形态变长,运动迁移能力增强,葫芦素B能抑制这种现象。MET结果显示:TPA能促进细胞的粘附贴壁,而葫芦素B能显著抑制细胞的粘附贴壁。　　 2、划痕实验和transwell显示TPA能显著促进两种肝癌细胞的侵袭或转移,葫芦素B能抑制肝癌细胞的侵袭或转移。　　 3、明胶酶谱和westernblot结果表明TPA能诱导HepG2细胞MMP-9酶活性以及蛋白的表达,葫芦素B能抑制MMP-9的酶活性和蛋白的表达。TPA作用与HepG2细胞后,p-ERK1/2,p-p38,p-Akt,NF-κB,C-Fos,C-Jun表达都升高,葫芦素B能剂量依赖性的抑制这些蛋白的表达。　　 结论：　　 TPA通过诱导MMP-9的表达促进肝癌细胞的侵袭和转移。葫芦素B能抑制TPA诱导的MMP-9的表达。葫芦素B可能通过阻滞MAPK(ERK1/2,P-38),PI3K/Akt信号通路来抑制转录因子NF-κB,AP-1的活性,进而抑制MMP-9的表达,最终抑制肝癌细胞的侵袭和转移。