【摘 要】
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目的:探究人参总蛋白对体内外PD模型的改善作用及对肠道微生物菌群的影响,为人参治疗PD提供科学及实验依据,也为进一步开发中药药物奠定基础。方法:（1）利用单因素试验和正交试验确定人参总蛋白的最佳提取工艺及纯化工艺;利用SDS-PAGE/二级质谱对人参总蛋白中的主要蛋白进行鉴定分析。（2）MPP+构建PC12细胞、SH-SY5Y细胞及BV2细胞体外PD模型,利用CCK-8法确定MPP+造模浓度及人参
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目的:探究人参总蛋白对体内外PD模型的改善作用及对肠道微生物菌群的影响,为人参治疗PD提供科学及实验依据,也为进一步开发中药药物奠定基础。方法:（1）利用单因素试验和正交试验确定人参总蛋白的最佳提取工艺及纯化工艺;利用SDS-PAGE/二级质谱对人参总蛋白中的主要蛋白进行鉴定分析。（2）MPP+构建PC12细胞、SH-SY5Y细胞及BV2细胞体外PD模型,利用CCK-8法确定MPP+造模浓度及人参总蛋白的给药浓度;应用CCK-8法、流式细胞术、线粒体膜电位检测法（JC-1）检测人参总蛋白对MPP+诱导的三种细胞PD模型的改善作用。（3）通过脑组织病理学实验及肠道微生物菌群分析探究长期喂养低、中、高剂量人参总蛋白对正常C57BL/6小鼠的毒性作用。（4）以MPTP给药浓度为35 mg/kg腹腔注射C57BL/6小鼠4周构建慢性PD模型,通过行为学实验、脑组织及肠组织病理学实验以及肠道微生物菌群分析探究长期喂养低、中、高剂量人参总蛋白对MPTP诱导的慢性PD模型C57BL/6小鼠的改善作用。（5）以MPTP给药浓度为35 mg/kg腹腔注射C57BL/6小鼠2周构建亚急性PD模型,通过行为学实验、脑组织病理学实验以肠道微生物菌群分析探究低、中、高剂量人参总蛋白对MPTP诱导的亚急性PD模型C57BL/6小鼠的改善作用。结果:（1）确定了人参总蛋白的最佳提取方式为4℃冷浸提取,提取p H为7.0,提取次数为3次,料液比为1:10,提取时间为每次8 h;通过纯化工艺优化确定人参总蛋白的最佳纯化工艺为等电点沉淀后超滤管超滤截留,纯化后蛋白纯度达到80.80%;通过SDS-PAGE/二级质谱确定人参总蛋白的主要蛋白依次是核糖核酸酶样主要贮存蛋白、类黄素依赖型氧化还原酶FOX5、类β-淀粉酶、类乳胶蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶、蛋氨酸合酶、铁氧还蛋白依赖的谷氨酸合酶1、前序列蛋白酶2。（2）确定了MPP+对PC12、SH-SY5Y和BV2三种细胞的最佳造模浓度分别为1 m M、0.5 m M和0.2 m M。25-200μg/m L的人参总蛋白对三种细胞均无明显毒性。应用CCK-8法、流式细胞术、线粒体膜电位检测法（JC-1）检测,结果表明各剂量组（25μg/m L、50μg/m L和100μg/m L）人参总蛋白对MPP+诱导的三种细胞PD模型均具有改善作用。与模型对照组比较,除中剂量组人参总蛋白对BV2细胞的改善作用无统计学意义外,其余差异均具有统计学意义。（3）服用各剂量组人参总蛋白的正常C57BL/6小鼠与空白对照组相比,体重等生命指标无显著变化,海马体与纹状体无明显改变,α-Syn与TH表达无显著差异,肠道微生物菌群多样性无明显改变。（4）悬挂绳实验、转轴实验、悬尾实验、水迷宫实验及旷场实验结果表明,人参总蛋白低、中、高剂量组均可显著改善慢性PD模型小鼠的行为障碍。脑组织及肠组织病理学实验结果表明,各剂量组均可显著改善小鼠脑海马体细胞分布、纹状体质间区分布、降低α-Syn聚集、升高TH表达、减少肠组织炎症浸润以及增加肠组织杯状细胞。肠道微生物菌群分析结果表明,各剂量组均可在一定程度上改善慢性PD模型小鼠肠道微生物菌群紊乱。（5）悬挂绳实验和转轴实验结果表明人参总蛋白可一定程度上改善亚急性PD模型小鼠的行为学障碍。脑组织病理学实验结果表明人参总蛋白可改善亚急性PD模型小鼠脑组织海马体细胞排列不均,纹状体质间区分布,同时可减少α-Syn的富集以及增加TH的表达。肠道微生物菌群分析结果表明,人参总蛋白可一定程度改变亚急性PD模型小鼠的肠道菌群紊乱。（6）人参总蛋白对亚急性PD模型小鼠的改善效果弱于对慢性PD模型小鼠的改善效果。结论:（1）本研究所建立的人参总蛋白提取和纯化工艺,提取率和纯度较高。SDS-PAGE/二级质谱鉴定表明核糖核酸酶样主要贮存蛋白、类黄素依赖型氧化还原酶FOX5、类β-淀粉酶为含量较高的单体蛋白。（2）人参总蛋白对PC12、SH-SY5Y和BV2三种细胞PD模型的均具有显著改善作用。（3）人参总蛋白可改善慢性PD模型C57BL/6小鼠的行为学障碍、脑组织及肠组织病理损伤及肠道微生物菌群紊乱。（4）人参总蛋白可一定程度改善亚急性PD模型C57BL/6小鼠的行为学障碍、脑组织病理损伤及肠道微生物菌群紊乱。
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