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目的:运用网络药理学模型构建牡丹皮及复方双丹方防治糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)的复杂网络模型,并采用体内外实验对牡丹皮及复方双丹方防治DKD进行整合机制的研究。 方法:1.运用Pubchem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)以及化学数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb)检索搜集药物中的化学成分,然后采用TCMSP数据库(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)对检索出的各成分进行筛选,确定出活性成分;利用TTD、DrugBank数据库结合文本挖掘补充DKD及其发病密切相关的肾小球、系膜细胞以及内皮细胞损伤的相关靶点。使用Cytoscape(3.4.0)软件(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/),构建成分-靶点网络图;利用OmicsBean组学数据整合分析云平台以及MAS3.0生物分子功能注释系统(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/),对筛选出的蛋白进行KEGG Pathway分析以及GO分析。 2.采用高糖高脂联合链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导SD大鼠II型糖尿病肾病模型,评价牡丹皮及复方双丹方对疾病的治疗作用。观察DKD大鼠体重、血糖及肾功能参数的变化,对肾脏进行HE、PAS染色,观察大鼠对肾脏组织病理形态学的改变,Western blot分析大鼠肾脏细胞间黏附因子(ICAM-1)、纤粘蛋白(FN)、IV型胶原蛋白(Col IV)表达情况以及牡丹皮及复方双丹方对TGF-β1信号通路以及p-38-erk1/2通路的调控作用。 3.基于课题前期研究基础对丹参主要活性成分进行了分离表征。采用乙醇加热回流法对丹参酮类组分进行提取,并用大孔树脂吸附技术对组分进行纯化,高效液相色谱对有效成分进行检测及分析。采用水提法对丹参酚酸类组分进行提取分离,运用大孔树脂吸附技术对提出的丹参酚酸组分进行纯化,高效液相色谱仪对其中活性成分进行表征。 4.培养MPC-5细胞,CCK-8计数法研究牡丹皮及复方双丹方有效成分对细胞存活率的影响。高糖诱导细胞损伤,免疫荧光检测细胞中Nephrin、Podocin、CD-2AP蛋白表达水平,流式细胞仪检测MPC-5细胞的凋亡现象。 5.培养HBZY-1细胞,基于前期研究基础,运用CCK-8计数法研究牡丹皮及复方双丹方中有效成分对细胞的存活率影响。高糖诱导细胞损伤,ELISA及试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)、内皮素(Endothelin-1,ET-1)水平,观察牡丹皮及复方双丹方的抗氧化作用。 6.培养HUVEC细胞,CCK-8计数法研究牡丹皮及复方双丹方中四种有效成分对细胞存活率的影响。高糖诱导细胞损伤,Western Blot法检测HUVEC细胞中炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白介素1β(IL1-β)、肿瘤坏死因子α(THF-α)的蛋白表达情况,Western Blot法观察牡丹皮及复方双丹方对P38/ERK1/2信号通路以及PI3K/AKT信号通路的调控作用。 结果:1.牡丹皮及复方双丹方潜在调节通路显著性较强的有:AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、TNF signaling pathway、Pathways in cancers、Hepatitis B、FoxO signaling pathway,主要调节能量代谢、炎症应激、凋亡以及氧化应激等。 2.牡丹皮及复方双丹方可降低Ⅱ型糖尿病肾病大鼠血糖水平,减少尿蛋白含量。除此之外,丹参及复方双丹方能显著减少肾脏中ICAM-1、FN以及Col Ⅳ蛋白的表达量,改善由于持续高血糖诱发的肾小球病理损伤状态,可能机制为调节了TGF-β1/P38信号通路。 3.复方双丹方中7种水溶性成分丹酚酸B、丹参素钠、迷迭香酸、异阿魏酸、紫草酸、咖啡酸、原儿茶酸以及4种脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ,为该方中丹参的药效物质基础。 4.牡丹皮及复方双丹方中的有效成分可显著改善细胞损伤导致的Nephrin、Podocin、CD-2AP蛋白含量减少现象,保护由高糖诱导的MPC-5细胞凋亡而使细胞数量减少现象,保护由高糖诱导的MPC-5细胞损伤。其中,复方双丹方较牡丹皮单味药具有更好的保护作用。 5.牡丹皮及复方双丹方可提升因高糖诱导而下降的HBZY-1细胞活力,降低内皮素与一氧化氮的水平,并抑制NOS的产生,对抗氧化应激所引起的细胞损伤。 6.牡丹皮及复方双丹方可降低由高糖引起的细胞中炎症因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、白介素1β(IL1-β)、肿瘤坏死因子α(THF-α)的蛋白表达。其机制为下调了P38/ERK1/2信号通路、PI3K及P-AKT水平,从而保护内皮损伤。 结论:牡丹皮及复方双丹方主要调节糖尿病肾病AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、TNF signaling pathway、Pathways in cancers、Hepatitis B、FoxO signaling pathway,经过体内外实验研究表明牡丹皮及复方双丹方可通过干预抗氧化应激、炎症应激、细胞凋亡等生理病理过程进而改善II型糖尿病肾病的肾脏损伤状态,对P38/ERK1/2信号通路、PI3K/AKT信号通路、TGF-β1信号通路具有调节作用。