【摘 要】
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该文由两部分组成.第一部分,重组人血清白蛋白在Pichiapastoris中的表达.为获得高产稳产人血清白蛋白的Pichiapastoris细胞株用于高密度发酵,克建了多种分泌表达载体,在Pichi
【机 构】
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中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所
【出 处】
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中国科学院上海生物化学研究所 中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学
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该文由两部分组成.第一部分,重组人血清白蛋白在Pichiapastoris中的表达.为获得高产稳产人血清白蛋白的Pichiapastoris细胞株用于高密度发酵,克建了多种分泌表达载体,在Pichiapastoris中表达,研究表达载体构建等因素对表达量的影响.用G418平板,ELISAblot和小规模表达的方法筛选高表达株,最后得到两个甲醇利用表型不同的高表达株.对其中的一个高表达株(甲醇利用缓慢型)的表达条件进行优化,研究了氨基酸、生物素、金属离子、表面活性剂对表达量的影响.以2-脱氧葡萄糖甲醇培养基作为筛选培养基,用紫外诱变法得到AOX1启动子不受葡萄糖抑制的突变株,能在葡萄糖和甲醇的同时存在下快速生长和分泌人血清白蛋白.第二部分,胞外青霉素G酰化酶的基因工程和蛋白质工程.用PCR方法从巨大芽孢杆菌的基因组DNA中扩增到青霉素G酰化酶基因,并装载到枯草杆菌表达质粒pPZW103(P43为启动子)中,将其转化为枯草芽孢杆菌中进行了分泌表达.为进一步提高表达量,对分泌表达青霉素G酰化酶(PGA)的基因工程枯草杆菌菌株的表达条件进行了优化.为了提高巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的稳定性,以大肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板,用PMODELING预测茂大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构,建立模型,预测若将β亚基427位(突变A)和430位(突变B)赖氨酸残基突变为丙氨酸,可能可以降低酶的等电点,增加疏水性,从而提高其在酸性和有有机溶剂环境中的稳定性.
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