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第一部分重症肌无力患者外周血细胞上ICOS和PD-1共表达及意义目的:研究重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者外周血单个核细胞上ICOS、ICOSL的表达特性及PD-1、ICOS在CD4+T淋巴细胞上的共表达,探讨正、负性共刺激信号失衡在重症肌无力病理过程中的作用。方法:应用免疫荧光标记的流式细胞术检测69例MG患者和55例健康对照者(healthy control,HC)外周血CD4+T细胞表面ICOS,单核细胞和B淋巴细胞表面ICOSL的表达。同时分别检测ICOS、PD-1在CD4+和CD8+T细胞亚群的共表达。结果:(1)外周血CD4+T淋巴细胞上ICOS的表达,MG组(54.43±35.34)%显著高于HC组(15.61±10.20)%,P<0.001。MG胸腺瘤组CD4+细胞亚群上ICOS阳性表达百分比为(70.81±21.98)%较MG胸腺正常组的(49.99±7.90)%明显升高(P=0.018)。MG组CD4+T细胞ICOS表达阳性百分比在不同性别、发病年龄、临床分型组间比较无显著差异。(2)CD14+单核细胞上的ICOSL阳性表达百分比,MG组(45.33±22.97)%较HC组(37.59±18.11)%明显升高,P<0.05,CD19+B淋巴细胞上ICOSL的表达,MG组(40.26±25.14)%较HC组(30.01±18.81)%,明显升高(P=0.014)。MG组CD14+单核细胞和CD19+B淋巴细胞上ICOSL表达阳性百分比在不同性别、发病年龄、临床分型、胸腺情况分组间比较无显著差异(3)CD4+T细胞上的PD-1+ICOS+亚群百分比,MG组为(10.60±9.25)%较HC组(2.69±1.86)%明显升高(P<0.0001);MG胸腺瘤组为(16.09±11.05)%较MG胸腺正常组(9.31±8.57)%升高,P<0.05。MG组CD4+T细胞上的PD-1+ICOS+亚群百分比在性别、发病年龄、临床分型分组间比较无显著性差异。CD8+T细胞上的PD-1+ICOS+亚群阳性百分比,MG组为(7.67±7.43)%较HC组(3.25±3.12)%明显升高(P<0.001)。结论:MG患者外周血中CD4+T细胞上的ICOS+亚群、CD19+B淋巴细胞和CD14+单核细胞上的ICOSL+亚群表达较HC组均显著升高,提示ICOS/ICOSL正性信号通路发挥了调节作用。mg患者外周血中pd-1、icos在cd4+t细胞上共表达较对照组显著升高,提示cd4+t细胞上的pd-1+icos+亚群参与了mg免疫病理过程。第二部分重症肌无力患者外周血中膜型和可溶性pd-1、pd-l1的表达及意义目的:研究重症肌无力患者外周血中膜型和可溶性pd-1、pd-l1的表达特性,探讨pd-1/pd-l1途径在mg免疫病理中的作用机制。方法:应用免疫荧光标记、流式细胞术检测69例mg患者和55例健康对照者外周血t细胞亚群上膜型pd-1和单核细胞亚群上膜型pd-l1的表达。按照性别、年龄、临床分型和胸腺是否正常进行分组配对,选取29例mg患者和25例健康对照者的血清用elisa法检测可溶性pd-1和pd-l1的表达。结果:(1)mg组cd4+t细胞上pd-1表达阳性百分比为(17.02±1.26)%较hc组的(10.62±0.92)%明显升高(p<0.001)。mg胸腺异常组cd4+t细胞上的pd-1阳性百分比为(22.48±2.43)%较mg胸腺正常组(16.2±1.34)%明显升高(p<0.05)。mg组cd4+t淋巴细胞上的pd-1阳性百分比在性别、发病年龄、临床分型各组间比较无显著性差异。(2)mg组cd14+单核细胞pd-l1阳性表达为(44.51±3.81)%较hc组(12.46±1.17)%明显升高(p<0.0001),在性别、发病年龄、临床分型、胸腺情况分组之间比较无显著差异(3)mg患者血清中可溶性pd-1(spd-1)表达(1.87±0.64)ng/ml较hc组(1.49±0.70)ng/ml明显升高(p=0.043),早发型患者spd-1浓度为(2.24±0.49)ng/ml明显高于晚发型患者(1.7±0.63)ng/ml,(p=0.032),spd-1分泌水平与患者年龄呈负相关(r=-0.484,p=0.008)。mg患者血清中spd-1表达在性别、临床分型、胸腺情况各组间比较无显著性差异。(4)mg组可溶性pd-l1(spd-l1)浓度为(0.20±0.16)ng/ml较hc组的(0.16±0.05)ng/ml无明显差异(p>0.05)。mg组spd-l1表达在性别、发病年龄、临床分型、胸腺情况各分组间比较无显著性差异。结论:mg患者cd4+t细胞上的pd-1+亚群和cd14+单核细胞上的pd-l1+亚群表达增加提示pd-1/pd-l1参与了mg的免疫病理,且pd-1/pd-l1信号途径存在功能障碍,推测是高分泌的spd-1相对过剩,干扰pd-1/pd-l1信号途径有关。发现pd-1/icos共表达的cd4+t细胞上,spd-1的相对过量表达,可能引起pd-1/pd-l1负性信号转导障碍而icos/icosl正性信号过强,是导致该类细胞过度活化,mg疾病进展的机制之一。第三部分重症肌无力患者血清中细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ分泌水平及意义目的:研究T细胞各亚群的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A在MG患者中的分泌情况,探讨其与MG患者正负性共刺激分子ICOS/PD-1表达失衡的相关性。方法:选取MG患者29例和25例健康对照者用ELISA法检测血清中IL-4、IL-17A、IFN-γ、抗AchR-Ab的浓度。结果:(1)MG患者血清中IL-4表达(6.252±2.455)pg/ml高于HC组(5.409±1.231)pg/ml,P=0.04;早发型MG患者IL-4分泌为(7.643±3.142)pg/ml明显高于晚发型患者(5.335±1.424)pg/ml,P=0.015,且MG患者血清中IL-4的浓度与患者年龄呈负相关(r=-0.403,P=0.009)。MG组IL-4表达在性别、临床分型、胸腺情况各分组间比较无显著性差异。(2)MG患者血清中IL-17A(50.763±13.102)pg/ml与HC组(63.482±30.641)pg/ml比较分泌减少(P=0.01)。MG组IL-17A表达在性别、发病年龄、临床分型、胸腺情况各分组间比较无显著性差异。(3)MG患者血清中IFN-γ表达(17.121±3.171)pg/ml与HC组(19.094±8.00)pg/ml无显著差异(P=0.117)。MG组IFN-γ表达在性别、发病年龄、临床分型、胸腺情况各分组间比较无显著性差异。(4)MG患者血清中抗Ach-Ab阳性占64%,全身型患者抗体阳性率为80%,眼肌型为53%,MG合并胸腺瘤患者抗体阳性率为92%。抗AchR-Ab阳性MG患者血清中抗体浓度与sPD-1、IL-4、IL-17A、IFN-γ无显著的相关性。结论:MG患者血清中IL-4表达上调、IL-17A表达下调,而IFN-γ较对照无显著差异,提示MG患者的炎性细胞因子异常表达,相关的Th细胞异常活化。本实验进行了MG患者sPD-1与细胞因子的相关性研究,发现活化的Th2细胞及其分泌的IL-4可能与sPD-1表达上调有关。