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研究背景:糖尿病患者在行外科血管重塑术或经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）后,相比于非糖尿病患者其血管更易发生再狭窄。当血管损伤后,内膜新生在血管再狭窄过程中扮演着重要的角色,但其具体的发生机制目前还没有被阐明。血管平滑肌细胞（VSMC）的异常增殖和迁移目前被普遍认为是血管受损后内膜新生的关键病理基础。高血糖和其他常见的因素如肥胖和高血脂等能够通过增加血管损伤后的氧化应激反应,以此来促进血管内膜的异常性增生。因此,治疗糖尿病患者PCI术后的心血管并发症,寻找一个靶向抑制内膜新生和血管重塑的新型分子是一种可行的方案。线粒体转位蛋白（TSPO）是一种广泛存在于细胞中分子量为18 kDa的蛋白,其最初被定性为外周性苯二氮卓类受体（PBR）。TSPO主要位于线粒体外膜上,已经被证实参与了很多重要的细胞程序,如增殖、凋亡、类固醇的合成、免疫调节、基因表达和线粒体生理过程。TSPO与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的相互作用将活性氧（ROS）的产生与抗氧化反应的诱导联系起来,并维持了细胞内氧化还原反应的稳态。研究证实TSPO基于线粒体外膜途径,能够调控神经元细胞中细胞内Ca2+和活性氧的转运而发挥神经毒性作用。并且TSPO被认为是一种多功能的分子,可以为具有高亲和力的和成型配体提供位点而发挥生理作用。大量研究已经证实,TSPO配体能够抑制多种肿瘤细胞系的增殖,比如黑色素瘤、结肠癌、食管癌、胸腺癌、星形胶质细胞瘤和乳腺癌。研究证实,经典的TSPO配体Ro5-4864对糖尿病神经病变有保护作用,并且一些高亲和性配体能够调控TSPO的功能,从而进一步调控葡萄糖的稳态和细胞内能量的产生。但是,TSPO配体在冠脉再狭窄和Ⅱ型糖尿病引起的心血管并发症中的作用并未被阐述。基于以上观点,我们提出假设:TSPO是糖尿病患者血管成形术后内膜新生过程中关键的靶点。在我们的研究中,我们探讨了TSPO配体PK 11195和Ro5-4864对VSMC的增殖和迁移的影响,并且还调查研究了PK 11195能否作为一种潜在的化合物去抑制糖尿病患者血管成形术后的内膜新生过程。研究目的:1.观察并描述TSPO在高糖诱导的VSMC增殖和迁移过程中的作用。2.观察TSPO配体对高糖诱导的VSMC增殖和迁移的影响。3.探讨TSPO配体抑制高糖诱导的VSMC增殖和迁移作用的潜在机制。4.在体实验中研究TSPO配体对高血糖引起的内膜新生过程的影响。研究方法:1.腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导高血糖大鼠模型。25 mM浓度的高糖刺激A10细胞不同的时间,或者用不同浓度的葡萄糖刺激A10细胞24小时。用免疫荧光染色、免疫印迹（WB）和定量聚合酶链式反应（QT-PCR）的方法检测TSPO的表达。2.用TSPO的小干扰RNA（siRNA）或其配体（PK 11195和Ro5-4864）抑制细胞内TSPO的功能。然后用细胞计数和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）的方法检测A10细胞的增殖情况,用划痕实验和侵袭小室实验检测A10细胞的迁移。3.25mM浓度的高糖刺激A10细胞,并用cGMP、PKG抑制剂观察cGMP和PKG在PK 11195抑制A10细胞增殖和迁移中的作用。A10细胞的增殖用MTT法检测,用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定cGMP的活性。4.Ⅱ型糖尿病大鼠行球囊损伤术诱导颈动脉内膜增生,同时每周两次经腹腔注射PK 11195（3 mg/千克）,连续注射两周后麻醉处死大鼠,收集损伤的颈动脉和对侧颈动脉。苏木素-伊红染色（HE）和免疫荧光染色观察评估PK 11195对动脉内膜新生的作用。研究结果:1.免疫印迹和免疫荧光结果均显示TSPO在高血糖大鼠动脉中的表达相比于对照组明显升高。用高糖刺激A10细胞,免疫印迹结果显示TSPO的表达也明显升高,并且呈浓度和时间依赖性。2.MTT法、划痕实验和侵袭小室实验检测结果均提示:用siRNA或TSPO配体PK 11195或Ro5-4864干扰A10细胞内TSPO的功能后,其高糖诱导的细胞增殖和迁移均被明显抑制,并且呈明显的剂量依赖性。3.对于PK 11195抑制高糖诱导的A10细胞增殖和迁移的潜在机制研究中,用MTT法检测A10细胞增殖情况,发现PK 11195的抑制作用能够被cGMP的阻断剂ODQ所阻断,而非被cAMP的阻断剂cAMP-Rp所抵消。因此,我们检测了cGMP下游的信号分子PKG对此抑制作用的影响,我们发现PK 11195的抑制作用也能够被PKG的阻断剂KT5823所阻断。同时,我们用ELISA的方法检测了cGMP的活性,结果发现高糖能够减少cGMP的产生,而PK 11195可以逆转高糖引起的cGMP活性的降低,而PK 11195的这种作用又能够被ODQ所阻断。以上结果证明,PK 11195通过cGMP/PKG信号通路调解高糖诱导的A10细胞增殖和迁移过程。4.Ⅱ型糖尿病大鼠行颈动脉球囊损伤术,观察PK 11195对内膜新生的影响。HE染色结果发现PK 11195能够明显减轻受损颈动脉的内膜新生,免疫荧光染色结果发现PK 11195能够抑制VSMC中核增殖抗原（PCNA）的表达,以上结果提示这种抑制作用主要是因为PK 11195抑制了VSMC的增殖和迁移。结论:我们的研究结果揭示了TSPO在Ⅱ型糖尿病大鼠颈动脉损伤模型内膜新生过程中的重要作用,并且还发现TSPO配体PK 11195能够通过cGMP/PKG信号通路抑制VSMC的增殖和迁移,从而发挥抑制高糖介导的内膜新生的作用。意义:我们的研究表明通过抑制TSPO的功能,能够抑制高血糖引起的VSMC的增殖和迁移,减轻糖尿病患者血管成形术后引起的动脉粥样硬化和再狭窄。TSPO有可能成为糖尿病患者血管成形术后引起动脉重塑的潜在治疗靶点。