动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心脑血管疾病(如冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑卒中等)共同的病理生理基础,而外周细胞内胆固醇代谢障碍是动脉粥样硬化的重要发病机制。过量胆固醇从肝外组织中的清除是预防和治疗AS的关键步骤。ATP结合盒转运体Al (ATP-binding cassette transporter Al, ABCA1)是ATP结合盒转运体超家族成员之一,是一种重要的以ATP为能源转运各种离子、脂类等细胞代谢物的膜转运蛋白。ABCA1可介导细胞内磷脂和游离胆固醇转运至贫脂或无脂的载脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ, apoA-I),从而促进高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)生成。此过程被誉为脂质外流的限速步骤,在胆固醇逆转运过程中发挥重要作用。研究发现,ApoA-I与ABCA1是类似于一种受体-配体的相互作用来发挥其功能的。据此原理,我们建立了基于与ABCA1结合的ApoA-I的cell-ELISA-like的高通量筛选模型,对本实验室的合成和天然产物化合物库进行大规模筛选,以其发现调节ABCA1活性的化合物,为治疗抗动脉粥样硬化的新型先导化合物的出现奠定基础。本研究采用trizol法提取MRC-5细胞总RNA,经逆转录合成cDNA。以此cDNA为模板,采用高保真的Prime Star DNA聚合酶和分段PCR的策略,进行限制性内切酶分析后,我们从其内部选择了xho I、EcoR I、Nhe I三个酶切位点,ABCA1 cDNA两端分别添加了sac I和salⅠ酶切位点,分段克隆了1823bp,1061 bp,2750 bp和1664bp的片段,与pMD-19T simple载体连接并测序正确后,酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP载体连接构建成功ABCA1 (cDNA全长6789bp)的真核表达载体。将构建成功的载体转入CHO细胞,以G418 500μg/ml的浓度筛选出稳定表达ABCA1的单克隆细胞,以此单克隆细胞包被96孔板,加入8μg/ml ApoA-Ⅰ为配基,孵育2小时后,依次加入anti-ApoA-I一抗和相应二抗,TMB显色,450nm测定OD值。经各项条件优化后,建立起以ABCA1为靶标的cell-ELISA-like高通量筛选模型,以ABC家族抑制剂格列本脲为阳性药对模型进行评价,接着对本室2600个天然和合成化合物库进行了筛选,从中发现了一种氧杂葸酮(口山酮)类化合物№2026791具有明显的上调ABCA1活性的作用,其在50μM时上调活性达30%。流式细胞术和western-blot分析均证实了№2026791增加了细胞表面ApoA-I的结合,证实№2026791可能为上调ABCA1介导的脂质外流活性的激动剂。本研究建立的ABCA1为靶标的cell-ELISA-like高通量新药筛选模型,可用来筛选对ABCA1脂质外流活性起调节作用的合成化合物及天然产物提取物,具有一定的创新性和广泛的实用性。筛选得到的阳性化合物№2026791经多种方法证实,具有潜在提高ABCA1脂质外流活性的能力,可为新型抗AS的先导化合物的发现创造了条件。钠钾ATP酶(Na/K-ATPase),又称钠泵,是P型ATP酶的一员,存在于大多数动物细胞的细胞质膜中。早在1957年Skou等人发现其可作为ATP能量驱动的离子泵之后,它的离子转运功能及其相关的调节已得到深入的研究。虽然早期的研究表明此酶同样也在基因的表达和细胞的生长方面扮演重要角色,但直到近几年才发现其可以组装多种信号分子形成信号转导复合物,引发信号转导的级联反应,并借以对不同蛋白的功能进行调节。在质膜上它能够与Src结合形成二元受体并与小窝蛋白一起组装成信号转导复合物,借助Src激酶反式激活内皮生长因子受体EGFR,激活胞内信号转导的级联反应,参与细胞的生长和调控。研究钠钾ATP酶及其信号转导机制将有助于发现在肿瘤和心血管治疗方面找到新的药物靶点。本研究采用密度梯度离心的方法,从猪肾中分离出了高纯度高活性的Na/K-ATPase蛋白。采用酶学的方法建立以Na/K-ATPase为靶点的高通量筛选模型,以测定其水解产生的Pi的量反映其活性的大小。以此模型对本室化合物库中2600个化合物进行了高通量筛选,共得到18个阳性化合物,均显示出对Na/K-ATPase有一定的抑制作用。其中6个具有相似结构,同属羟基口山酮类化合物。构效关系研究表明羟基的数目和位置对其活性至关重要。量效关系曲线表明,此类化合物不同于强心苷类代表药物乌本苷(ouabain),其对Na/K-ATPase呈现双相抑制作用,说明可能作用于Na/K-ATPase的两个不同构象。已经进行的实验研究发现,这一类化合物更易结合Na/K-ATPase的E1样构象,不同于ouabain的E2构象。并且这类化合物可以在一定程度拮抗ouabain与Na/K-ATPase的结合。显示了其作为强心苷类物质的潜在拮抗作用。新发现的这类羟基口山酮类化合物作为Na/K-ATPase的新配体,将有助于研究Na/K-ATPase构象的变化和离子转运、信号转导等生理功能,有助于更好的理解Na/K-ATPase在机体中或细胞的正常生理活动中扮演的角色和重要作用。