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帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种以中脑黑质部位多巴胺能神经元的变性死亡导致脑内多巴胺的含量大量减少为其病理特征的神经退行性疾病。该病以60多岁的老人多见，多表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓等症状。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（Mesencephalic Astrocyte-Derived NeurotrophicFactor, MANF）是一种保守型神经营养因子，早期被称为富含精氨酸的肿瘤早期突变基因（Arginine-rich Mutated in Early Stage Tumors，Arginine-rich Protein，ARMETor ARP），在体外可特异性保护多巴胺能神经元，内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激可上调其表达。目前已有研究发现预防性给予MANF可对帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元损伤的产生保护作用，MANF能否对已存在的损伤产生明确的治疗作用，目前仍缺乏足够的实验证据。本研究采用6-羟多巴（6-OHDA）制备帕金森病大鼠模型，待症状出现后给予MANF，观察MANF对帕金森病模型大鼠的治疗作用。目的：观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（MANF）能否减轻由6-OHDA引起的大鼠中脑黑质部位多巴胺能神经元损伤，为MANF能否作为帕金森病的临床治疗药物提供实验依据。方法：1.重组人MANF蛋白的制备将pET28a(+)-MANF质粒转化至感受态DH5α中，抽提质粒，重新转化至感受态BL21中，扩大培养，然后利用IPTG诱导MANF表达。提取BL21中MANF蛋白，用预装好的Ni-beads柱进行亲和层析纯化，随后进行蛋白浓缩和蛋白浓度测定并分装保存。2.大鼠帕金森病模型的制备及治疗给药利用大鼠脑立体定位仪将6-OHDA注射至大鼠右侧纹状体区域以制备大鼠帕金森病模型。于6-OHDA注射后第三周大鼠症状出现，然后将三个剂量（5μg、10μg、20μg）纯化的MANF蛋白注射至模型大鼠纹状体区域（与6-OHDA损伤位点相同），并用司来吉兰（腹腔注射，ip）作为阳性对照组，纹状体直接注射PBS作为阴性对照组。3.行为测试及组织学检测采用行为学观察检测大鼠旋转行为：将阿扑吗啡（Apomorphine）腹腔注射至各组模型大鼠体内，观察30min内大鼠由损伤侧向健侧的旋转行为并计数。免疫组化方法分别检测各组大鼠黑质、纹状体部位酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）阳性的神经细胞和神经纤维的数量，并计算平均光密度。同时用免疫组化方法检测PD模型大鼠黑质部位Caspase-3活性片段的表达，观察细胞凋亡情况。结果：1.重组人MANF蛋白质的纯度及浓度带有His标签的MANF蛋白以可溶性形式存在于大肠杆菌裂解产物中，本研究中获得了纯度和浓度均较高的MANF融合蛋白以用于本药效学研究。2.帕金森病大鼠模型的成功复制在本研究过程中，我们分批次造模。待模型复制稳定后，一次性使用68只SD大鼠，其中60只用于制备PD大鼠模型，其余8只用作假手术对照。造模三周后观察经阿扑吗啡诱导的大鼠旋转行为，其中30min内旋转次数超过210次为成功的PD大鼠模型。在该批次造模中，60只造模大鼠中有43只符合模型成功标准，造模成功率为71.67%。随后对这43只造模成功的大鼠进行分组，每组8-9只模型大鼠，用于观察MANF的疗效。3.重组人MANF对PD大鼠行为的影响PD大鼠的行为学检测共进行4次，分别为各实验组于6-OHDA损伤后的第3、6、8、10周进行。大鼠腹腔注射阿扑吗啡后5min左右开始观察，计数30min内大鼠由损伤侧向健侧的旋转行为。结果显示，给药后各组大鼠旋转圈数均有不同程度的减少，其中MANF10μg组以及SEL组在给药后旋转圈数明显少于PBS组（P<0.01），但MANF10μg组和SEL组之间的差异并不显著（P>0.05）。MANF5μg组以及20μg组同PBS组比较行为学改善不明显（P>0.05）。4.重组人MANF对PD大鼠纹状体部位TH阳性神经纤维平均光密度的影响给予PBS的PD大鼠，其损毁侧纹状体中TH阳性神经纤维平均光密度明显小于其健侧。而给予MANF的PD大鼠，各剂量组中的TH阳性神经纤维平均光密度均有不同程度的增加，其中MANF10μg组恢复最为明显(P<0.01)，其余各组亦有所改善（P<0.05）。5.重组人MANF对PD大鼠黑质部位TH阳性神经细胞数量的影响给予PBS的PD大鼠，其损伤侧黑质部位TH阳性细胞数明显少于未损伤侧。而给予MANF的PD大鼠，各剂量组中TH阳性细胞的存活数均有不同程度的改善，其中MANF10μg组TH阳性细胞数恢复最为明显(P<0.01)，且同MANF5μg组比较其疗效差异具有显著性（P<0.05）。6.重组人MANF对PD大鼠黑质部位Caspase-3活性片段阳性细胞数的影响给予PBS的PD大鼠，其损伤侧黑质部位Caspase-3活性片段阳性细胞数明显多于健侧；给予MANF10μg的PD大鼠，损伤侧黑质部位Caspase-3活性片段阳性细胞数多于未损伤侧，但少于PBS组大鼠损伤侧黑质部位Caspase-3活性片段阳性细胞数。结论MANF能减轻由6-OHDA诱导的大鼠多巴胺能神经元的损伤。