胰腺导管腺癌恶性程度高，缺乏早期诊断手段，多数患者确诊时无法切除，即便是根治性切除，五年生存率亦不足20％。而传统的放化疗对胰腺癌作用有限，目前众多的新一代研究均关注于如何改善胰腺癌的预后。　　本课题，我们构建了一种携带白介素24(IL-24)基因的双靶向溶瘤腺病毒（MUD55-IL-24），借以用于胰腺癌的实验研究。我们首先删除腺病毒在正常细胞内复制必需，而在肿瘤细胞中复制非必需的E1B-55K基因，使其能特异性的在肿瘤细胞内复制扩增。此外，我们注意到多数胰腺导管腺癌高表达MUC1，而正常胰腺组织不表达或低表达，这一现象提示MUC1基因转录启动子活性在胰腺导管腺癌细胞中活性较高，利用胰腺癌细胞的这一特性，采用基因重组方法，以MUC1启动子代替腺病毒复制早期蛋白E1A基因的启动子，从而我们构建了这种能特异性地在胰腺导管腺癌细胞中复制增殖，溶解肿瘤细胞，而在正常细胞中复制能力较弱，毒副作用较小的病毒。为了增强这种双靶向溶瘤腺病毒的杀伤作用，我们将IL-24基因插入腺病毒基因组中构建病毒MUD55-IL-24，随着病毒的复制，IL-24也随之大量表达，从而发挥IL-24强大的抗肿瘤效应。本课题主要经过以下几方面研究:(1)构建、包装双调控溶瘤腺病毒及携带IL-24基因的双调控腺病毒并对其进行鉴定;(2)基因-病毒MUD55-IL-24体外特异性杀伤胰腺癌细胞能力研究;(3) MUD55的体内安全性和MUD55-IL-24的抑制皮下移植肿瘤能力的研究。　　第一部分基因-病毒MUD55-IL-24的构建及鉴定　　目的:构建并包装双靶向溶瘤腺病毒及携带IL-24基因的双调控腺病毒　　方法:使用TRIzol抽提多种腺癌细胞、非腺癌肿瘤细胞及正常细胞的RNA，以通用的反转录引物将所有的mRNA反转录成eDNA，使用实时定量PCR试剂盒Realtime Master Mix对不同细胞内的MUC1水平进行定量，并以GAPDH作为内参，实行相对定量。以质粒pDRIVE03-DF3(h)v2为模板，PCR扩增出MUC1启动子，将其克隆进pGL3-basic形成报告基因质粒pGL3-MUC1p。将质粒pGL3-MUC1p和内参质粒共转染入各种细胞系检测MUC1启动子的启动活性。同样以质粒为模板，PCR扩增出MUC1启动子，将它克隆入已经删除E1A启动子的质粒pZX2中，再将形成的质粒和pZD55均进行酶切后大小片段连接，构建双调控的小质粒pMUD55。从pZD55-IL-24上酶切下IL-24的基因表达框接入pMUD55中以构建pMUD55-IL-24。将构建产生的小质粒与pBHGE3共转染HEK293细胞，同源重组产生相应的病毒。铺胶挑空斑后扩增鉴定病毒，选取正确且无其他病毒污染的病毒进行大量扩增，在使用氯化铯梯度密度离心获得纯化的腺病毒，对病毒进行滴度测定。用病毒感染肿瘤细胞，在一定的时间收取细胞的蛋白，western检测病毒的蛋白的表达情况。　　结果:通过实时定量PCR检测发现，几种腺癌细胞中的MUC1的mRNA水平均较高，而正常细胞和非腺癌的肿瘤细胞中水平较低。对克隆产生的报告基因质粒pGL3-MUC1p进行测序，并与数据库中MUC1启动子序列进行比对，MUC1启动子序列正确。将构建好的质粒pGL3-MUC1p转染不同细胞系后检测MUC1启动子活性，结果发现MUC1特异性在腺癌细胞系中表现出高启动活性，与强启动子CMV启动子活性接近，而在多种正常细胞系和多种非腺癌肿瘤细胞系中，MUC1的启动活性较低，不到CMV启动活性的10％，三类细胞间MUC1基因启动子活性差异比较具统计学意义。通过同源重组的方式获得纯净的目的病毒，对病毒大量扩增后纯化，得到可以进行细胞实验和动物实验的病毒。测定各种病毒滴度，并根据病毒滴度计算后续加入细胞中和注射动物用病毒用量。使用病毒处理肿瘤细胞后收取蛋白检测病毒蛋白的表达情况，结果显示，除了非复制性病毒AD-IL-24外，其他病毒均能表达E1A; MUD55、MUD55-IL-24、ZD55、AD-IL-24不能表达E1B55K蛋白，而Ad.MUC1和Ad.WT表达E1B55K蛋白，所有病毒的蛋白表达情况均与预想一致，提示病毒构建正确。　　结论:通过同源重组的方式获得了与预设基因组一致的双靶向腺病毒和携带IL-24基因的双靶向腺病毒　　第二部分 MUD55-IL-24特异性杀伤胰腺癌细胞体外实验　　目的:检测基因-病毒MUD55-IL-24体外特异性杀伤胰腺癌细胞的能力　　方法:不同病毒分别感染正常细胞MRC-5和胰腺癌细胞PANC-1，分别于12 h、24 h，、36 h、48 h收集细胞蛋白，使用蛋白印迹方法检测病毒感染细胞后不同时间节点IL-24蛋白在细胞内表达水平的变化。同时，在这4个时间点分别收取病毒处理细胞的培养液，使用ELISA法检测上清中IL-24蛋白水平。用不同病毒分别处理96孔板中MRC-5细胞和PANC-1细胞，在不同时间点分别检测细胞稳定性。使用不同病毒处理PANC-1细胞，在48 h、72h、96h采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色方法检测病毒处理后凋亡细胞比例。　　结果:通过western和ELISA方法检测发现在MRC-5细胞内和上清中，MUD55-IL-24处理组IL-24表达水平与AD-IL-24处理组接近，两者差异无统计学意义(P＞0.05);而在PANC-1细胞内和上清中MUD55-IL-24介导的IL-24的表达显著高于AD-IL-24组，两者差异具统计学意义(P＜0.001); MUD55病毒在两组细胞的细胞内及上清液中IL-24表达极低。我们用MTT的方法检测AD-IL-24，MUD55及MUD55-IL-24三者在体外对MRC-5及PANC-1细胞株的杀伤效果，结果显示对于MRC-5，三者均未引起显著的细胞毒性，但在PANC-1细胞株中，MUD55-IL-24杀伤效率显著高于其他病毒。检测发现与对照病毒比较，MUD55-IL-24能显著提高诱导PANC-1细胞的凋亡比率。　　结论:基因-病毒MUD55-IL-24能特异性在胰腺癌细胞中大量表达IL-24蛋白，具有特异性杀伤胰腺癌细胞的特点。　　第三部分双调控病毒的体内安全性和抑制皮下移植瘤研究　　目的:检测双靶向病毒MUD55的体内安全性和基因-病毒MUD55-IL-24抑制皮下移植瘤的能力　　方法:采用尾静脉注射方式分别向裸鼠体内注射病毒PBS、Ad.MUC1、ZD55、MUD55、Ad.WT，每种病毒分为低剂量和高剂量组。在病毒注射后3天取裸鼠血检测ALT、AST水平，并比较各组之间两者水平的差异。取病毒处理裸鼠肝脏，制备石蜡切片进行HE染色，观察淋巴细胞浸润等炎症反应。抽提裸鼠肝脏RNA，反转录后进行定量PCR，检测肝脏中病毒蛋白E1A的表达水平。向裸鼠皮下注射PANC-1细胞形成移植瘤，待移植瘤达到一定大小后，瘤内注射PBS、AD-IL-24、MUD55、MUD55-IL-24，注射结束后测量肿瘤体积，每周测量两次，绘制不同病毒处理组裸鼠皮下移植瘤的生长曲线。同时每周测量两次裸鼠体重，观察病毒对裸鼠状态的影响。在肿瘤生长实验结束后处死裸鼠，将肿瘤取下称重并制备成石蜡切片，检测肿瘤组织中IL-24蛋白、hexon蛋白的表达水平，采用TUNEL法检测病毒引起的肿瘤凋亡情况。　　结果:尾静脉注射裸鼠实验发现，野生型腺病毒Ad.WT和单靶向腺病毒ZD55、Ad.MUC1可以引起裸鼠血清中的ALT及AST水平显著上升，诱发淋巴细胞浸润肝脏，具有一定的肝脏毒性;而双靶向病毒MUD55则几乎不影响血清ALT、AST水平，淋巴细胞浸润现象也不明显。肝脏中E1A mRNA水平检测显示，MUD55处理组裸鼠肝脏中的E1A水平明显低于其他三组，组间差异比较具统计学意义(P＜0.05)，这说明MUD55在裸鼠肝脏中的复制能力最弱。在PANC-1细胞株裸鼠皮下移植瘤动物模型中，肿瘤体积及肿瘤重量测量均显示MUD55-IL-24抑制肿瘤能力显著优于AD-IL-24及MUD55(P＜0.05)。肿瘤组织切片TUNEL染色结果显示MUD55-IL-24比非复制病毒组和单纯病毒组TUNEL阳性细胞更多。　　结论:双靶向病毒MUD55具有较好的体内安全性，基因-病毒MUD55-IL-24能有效的抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。