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转基因动物主要用于基因功能研究、人类遗传病动物模型以及在乳汁中表达重组蛋白，然而常规载体转基因由于受整合位点以及构件本身缺陷的影响，表达的不确定性是其主要缺陷，解决的主要途径之一就是利用具有独立表达域的基因组大片断作为表达框架来排除位置效应。酵母人工染色体（YAC）巨大的克隆能力能满足这个要求，YAC克隆（YACs）转基因在大部分情况下表现出了位置独立性、拷贝数依赖性、组织特异性以及与内源性基因相当的表达水平。本实验利用从法国人类多态性研究中心（CEPH）YAC库筛选出的含人α-乳白蛋白基因（human α-lactalbumin gene，ha-Lac）的长约210kb的YAC（HLA-YAC），用于在转基因羊的乳汁中表达人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）。 CEPH YAC库是用酵母AB1380菌株构建的，该菌株缺少可用的遗传筛选标记，这给YACs的遗传学操作带来了难度。为了便于同源重组的筛选，借助YPH925的kar1突变，使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力，通过单个染色体在酵母间的转移，在药物筛选的条件下，把HLA-YAC由酵母AB1380转移到his3缺陷的YPH925菌株，经脉冲凝胶电泳和PCR方法证实，YPH925获得了来自AB1380的HLA-YAC。 为了探索用不同的筛选标记在酵母中对HLA-YAC定点打靶的可行性，构建了包含HIS3（对YPH925菌株）和G418R（对YPH925和AB1380两种菌株）两个筛选标记，以及ha-Lac的5’和3’端非翻译区各684 bp和940 bp的两个同源臂的打靶载体，用电转化或醋酸锂转化转入酵母内，初步以组氨酸缺陷或G418筛选，再以菌落PCR鉴定，并经克隆测序验证。结果显示，HLA-YAC受到了相应的定点打靶修饰，G418R的筛选效率高于HIS3，醋酸锂转化方法的阳性获得率稍高于电转化。 为了在转基因动物的乳腺中用ha-Lac调控元件指导重组人血清白蛋白基因（rHSA）的表达，在以上打靶载体的5’同源臂的下游克隆入从起始密码子至终止密码子并含有第1和第2内含子的mini-HSA，mini-HSA的polyA信号以及赋予动物细胞对G418产生抗性的neor表达盒来自pcDNA3载体，用醋酸锂转化方法把打靶载体转入酵母内，经G418R和组氨酸缺陷交叉筛选，菌落PCR初步鉴定，再经Southern杂交验证，证明酵母内的HLA-YAC在预想的位点完成了同源第乙军医大学硕}学位论文重组，构建了ha-Lac调控元件指导下在动物乳腺中特异性表达rHSA的嵌合体HLA一YAC。 目前，显微注射是YAC转基因家畜动物制备的唯一方法，该方法不仅要经过YAC在体外的分离和纯化等烦琐的操作步骤，而且、叭Cs整合率以及完整性都极低，致使yACs转基因动物制备成本过高。目前核移植克隆家畜动物已经是一种较为成熟的技术，本实验通过酵母与胎儿成纤维细胞融合的方法为核移植克隆YACs转基因家畜动物提供适宜的细胞株。把经溶菌酶消化去壁的酵母细胞原生质体与羊的胎儿成纤维细胞按50:1的比例在PEG 1 500介导下融合，并在G418中筛选，每1、10“细胞可获得1一25个抗性克隆，抽提抗性克隆细胞株基因组，用不同区域的多对引物对4个细胞抗性克隆进行PCR鉴定，并最终经Southem杂交验证，证实表达rHSA的嵌合体HLA.YAC保持完整地由酵母转入了胎儿成纤维细胞内，获得了用于核移植制备克隆动物的细胞株，其中的一个克隆将用来进行核移植制备转基因羊。