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本课题以正常SD大鼠及雄激素致不孕大鼠(androgeninducedsterilerats，ASR)作为研究对象，同时施加药物干预，观察各组大鼠卵巢血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)的基因、蛋白表达和HO-2蛋白表达情况，探讨了HO诱导剂对正常SD大鼠HO表达和卵巢功能的调节、无排卵的发生与卵巢HO表达的关系及补肾调经方对其影响；同时观察了各组大鼠卵巢性激素水平、卵巢形态学、卵巢指数等的变化，以探讨HO表达的变化与卵巢功能的关系及补肾调经方对其影响。
方法
一、正常雌性大鼠卵巢HO表达及其与卵巢功能的关系
1.正常SD大鼠卵巢HO的表达
采用3～4月龄健康雌性SD大鼠20只，随机分为2组。Hemin组颈背部皮下注射hemin，剂量30μm/kg；正常组颈背部皮下注射生理盐水，连续7天。同时进行阴道脱落细胞涂片检查，选择动情后期处死，采用免疫组织化学、原位杂交的方法，观察比较了2组大鼠卵巢HO-1基因和蛋白表达情况，HO-2蛋白表达的情况及卵巢病理形态变化。
2.正常SD雌性大鼠卵巢HO表达与卵巢功能的关系
动物分组、给药、处死情况同前，采用放射免疫和HE染色，观察比较了2组大鼠卵巢性激素水平、卵巢形态学、卵巢指数等变化。
二、ASR卵巢HO的表达与无排卵的关系
1.ASR卵巢HO的表达
选用同批出生9日龄健康雌性SD大鼠，颈背部皮下注射丙酸睾丸酮0.05ml/rat制作无排卵模型，正常组注射同等剂量的中性茶油作对照。第70日龄始连续阴道上皮细胞涂片两个性周期(每个性周期4～5天)，阴道上皮细胞持续角化，提示无排卵大鼠模型制作成功。随机分为2组：即模型组、正常组各10只。正常喂养同时每日灌服蒸馏水1ml/100g，连续7周。阴道上皮细胞涂片选择动情前期处死，采用免疫组织化学、原位杂交的方法，观察比较了2组大鼠卵巢HO-1基因、蛋白表达及HO-2蛋白表达情况，观察比较了2组大鼠卵巢形态学和卵巢指数等方面的变化。
2.ASR卵巢HO表达与无排卵的关系
动物造模、分组、处死情况同前，采用放免法和HE染色，观察比较了2组大鼠卵巢性激素水平、卵巢形态学、卵巢指数等的变化。
三、补肾调经方对ASR卵巢HO表达的影响
1.补肾调经方对ASR卵巢功能的影响
取40只成模大鼠随机分为四组：补肾调经方高剂量组(简称“高剂量组”)、补肾调经方低剂量组(简称“低剂量组”)、乌鸡白凤口服液组(简称“乌鸡组”)和模型组，每组各10只；同时取同龄雌性SD大鼠10只为正常组。80日龄开始，高、低剂量组灌服补肾调经方，乌鸡组灌服乌鸡白凤口服液，模型组和正常组灌服蒸馏水，每日一次。即模型组和正常组灌服蒸馏水；高剂量组灌服补肾调经方，剂量：53g·kg-1·d-1(相当于临床用量的20倍)；低剂量组灌服剂量：27g·kg-1·d-1，(相当于临床用量的10倍)；乌鸡组灌服剂量：1ml·kg-1·d-1(相当于临床剂量的20倍)，各组按照1ml/100g体重灌胃给药。给药7周，并阴道细胞涂片两个性周期最后一次给药后禁食8小时，阴道上皮细胞涂片选择动情前期处死，采用放免法和HE染色，观察比较了各组大鼠卵巢性激素水平、卵巢形态学、卵巢指数等的变化。
2.补肾调经方对ASR卵巢HO表达的影响
动物造模、分组、给药、处死情况同前，采用免疫组化和原位杂交法，观察比较了各组大鼠卵巢HO-1基因、蛋白表达和HO-2蛋白表达情况，并用图像分析系统对卵巢组织免疫组织化学染色和原位杂交结果进行定性半定量分析其变化。
所有数据均采用SPSS11.5统计软件，独立样本的T检验(IndependentSampleT-test)。多组均数采用方差分析法，两两之间的比较采用LSD法。相关分析采用Pearson检验。
结果
一、正常SD大鼠卵巢HO表达及其与卵巢功能的关系
1.正常SD大鼠卵巢HO的表达
在大鼠的动情后期，HO-1蛋白在颗粒细胞、黄体细胞表达，泡膜细胞表达阴性；正常组大鼠卵巢HO-1mRNA在颗粒细胞、黄体细胞表达，泡膜细胞表达阴性，和HO-1蛋白的表达部位一致。HO-2在卵巢颗粒细胞、黄体细胞中均有表达，泡膜细胞表达阴性。Hemin组大鼠HO-1mRNA在卵巢颗粒细胞、黄体细胞表达，免疫染色较正常组深。Hemin可诱导正常大鼠HO-1蛋白和基因的表达增强，而部位不变。
正常组、hemin组卵巢颗粒细胞HO-1蛋白表达平均灰度的均值分别为111.67±3.29、78.91±8.90，hemin组HO-1蛋白表达明显高于正常组(P＜0.01)。正常组、hemin组卵巢黄体HO-1蛋白表达平均灰度的均值分别为84.06±5.35、53.86±2.71，hemin组HO-1蛋白表达明显高于正常组(P＜0.01)。
2.正常SD大鼠卵巢HO的表达与卵巢功能的关系
正常组、hemin组卵巢在镜下见黄体组织及各期卵泡。hemin组黄体中血管较明显。
正常组、hemin组血清E2的均值分别为3.871±2.839、6.986±3.074，与正常组相比，hemin组明显提高(P＜0.05)；血清P的均值分别为3.969±2.066、6.801±1.474，与正常组相比，hemin组极显著升高(P＜0.01)；T的均值分别为2.444±1.784、3.086±1.163，与正常组相比，hemin组无明显差异(P＞0.05)。
二、ASR卵巢HO的表达
1.ASR卵巢HO的表达
在动情前期，正常组卵巢HO-1蛋白在颗粒细胞强，泡膜细胞和黄体细胞弱，ASR卵巢HO-1颗粒细胞和泡膜细胞极弱。正常组、模型组卵巢颗粒细胞HO-1蛋白表达平均灰度的均值分别为76.99±1.53、85.10±3.01，与正常组相比，模型组HO-1蛋白表达下降(P＜0.01)；正常组、模型组卵巢泡膜细胞HO-1蛋白表达平均灰度的均值分别为133.9±8.46、131。4±9.03，与正常组相比，模型组HO-1蛋白表达无明显变化(P＞0.05)。
2.ASR卵巢HO表达与卵巢功能的关系
动物一般状况：与正常组相比，模型组体重增加明显，活动较少，反应欠灵敏。
三、补肾调经方对ASR卵巢HO表达的影响
1.补肾调经方对ASR卵巢功能和形态的影响
(1)动物一般状况：模型组体重增加明显，活动较少，反应欠灵敏。其余各组大鼠均发育良好，毛色白而光泽，精神佳活泼，反应灵敏，饮食、二便正常，体重增加。
2.补肾调经方对ASR卵巢HO表达的影响
(1)各组HO-1蛋白的比较
正常组、模型组、高剂量组、低剂量组、乌鸡组卵巢颗粒细胞HO-1蛋白表达的平均灰度的均值分别为76.99±1.53、85.10±3.01、80.77±3.09、82.48±2.88、84.10±2.66，与模型组相比，补肾调经方高剂量组HO-1表达显著升高(P＜0.05)，低剂量组和乌鸡组的HO-1蛋白表达则无显著性差异(P＞0.05)。
(2)各组HO-2蛋白的比较
正常组、模型组、高剂量组、低剂量组、乌鸡组卵巢颗粒细胞HO-2蛋白表达的平均灰度的均值分别为81.39±2.77、106.13±2.95、87.64±2.87、86.01±2.61、95.23±5.21，与模型组相比，高剂量组、低剂量组、乌鸡组HO-1表达显著升高(P＜0.01)，高剂量组、低剂量组和乌鸡组相比有极显著性差异(P＜0.01)。高、低剂量组无显著差异(P＞0.05)。
结论
1正常大鼠动情后期，HO-1蛋白在卵泡颗粒细胞、黄体细胞表达，泡膜细胞表达阴性；正常组大鼠卵巢HO-1mRNA在颗粒细胞、黄体细胞表达，泡膜细胞表达阴性，和HO-1蛋白的表达部位一致。HO-2在卵巢颗粒细胞、黄体细胞有表达，泡膜细胞表达阴性。Hemin组大鼠HO-1mRNA在卵巢颗粒细胞、黄体细胞表达，免疫染色较正常组深。Hemin可诱导正常大鼠HO-1蛋白和基因的表达增强，而部位不变。对HO-2的表达无明显作用，诱导后使动情后期的E2和P水平增加，同时黄体中血管数目增加。说明正常情况下，HO可能参与了卵巢功能的局部调节。
2动情前期，正常组卵巢HO-1基因和蛋白在颗粒细胞表达强，泡膜细胞和黄体细胞表达弱，ASR卵巢HO-1颗粒细胞和泡膜细胞均弱。与正常组相比，模型组卵巢颗粒细胞HO-1基因和蛋白表达下降，卵巢泡膜细胞HO-1基因和蛋白表达无明显变化。
正常组HO-2在颗粒细胞表达强，泡膜细胞表达弱。ASR卵巢HO-2蛋白在卵泡外膜细胞强表达，颗粒细胞、卵泡内膜细胞弱表达。与正常组相比，模型组大鼠颗粒细胞HO-2蛋白表达显著下降，卵泡外膜HO-2蛋白表达显著增强。
结果显示，HO-1在ASR卵巢颗粒细胞表达弱于正常组，HO-2在ASR卵泡外膜细胞表达强于正常组。提示，无排卵的发生可能与HO的分布异常有关。
3补肾调经中药可上调HO-1基因和蛋白在卵巢颗粒细胞的表达，上调HO-2蛋白在卵巢颗粒细胞的表达，其中高剂量组对HO-1基因上调后，与正常组无显著性差异。说明，补肾调经中药促进卵泡发育和排卵的作用可能与上调HO-1和HO-2的表达有关。