论文部分内容阅读
新霉素和链霉素是被广泛应用于畜牧业中的氨基糖苷类抗菌药物,不合理的使用会造成其在动物源性食品中的残留,被人类食用后会对健康产生不利影响。因此,建立一种适用于现场检测新霉素和链霉素的快速检测方法,是强化市场监管所迫切需要的。适配体是一种对特定靶标具有高亲和力的单链寡核苷酸;量子点(QD)是一种可单一波长激发、多波长发射的纳米荧光材料;两者的结合可实现对新霉素和链霉素的高特异性和高亲和性的标记,有助于实现两者残留的同时快速荧光检测。本文对新霉素和链霉素适配体的筛选,适配体-QD复合荧光探针的制备,以及建立基于此荧光探针的多残留检测方法开展了研究,具体研究结果如下:(1)建立了筛选高特异性新霉素和链霉素适配体的方法。获得的主要方法参数包括:羧基化磁珠与新霉素和链霉素偶联的最大质量比为34:1和26:1;PCR退火温度60℃;上下游引物比例为30:1。(2)利用该方法首次获得彼此无交叉识别作用的高特异性新霉素适配体N1和链霉素适配体S11。适配体对新霉素和链霉素具有高亲和性,解离常数K_d值分别为40.96±11.56 nmol/L和44.94±7.37 nmol/L。(3)首次建立了采用Non-SELEX筛选链霉素适配体的方法,0-17 min为靶标-ssDNA复合物收集时间窗口。经过仅3轮筛选即可得到亲和力稳定的适配体候选物。利用该方法获得的适配体NS2对链霉素具有高亲和性和高特异性,解离常数K_d值为26.56±8.57 nmol/L。(4)优化了制备可以对新霉素和链霉素进行高特异性和高亲和性标记的两种复合荧光探针的条件,其中QD1和QD2的发射波长分别为548和580 nm;活化时间分别为4和15 min,QD1与N1及QD2与NS2的摩尔比分别为1:1.95和1:1.41;形成的偶联物N1-QD1和NS2-QD2的浓度分别为123和81 nmol/L;它们与氧化石墨烯(GO)生成复合荧光探针的反应时间为30 min,GO在两种复合荧光探针N1-QD1/GO和NS2-QD2/GO中的浓度均为300μg/mL。(5)首次建立了基于两种复合荧光探针对新霉素和链霉素进行多残留快速检测的方法,样品与荧光探针的反应时间为30 min,新霉素和链霉素检测的测定波长分别为550和586 nm,校正波长分别为618和518 nm。方法对新霉素和链霉素的线性检测范围分别为50-1000μg/L和10-1000μg/L,检出限分别为10.02和6.65μg/L。方法在牛奶样品中对新霉素和链霉素的加标回收率分别在96.12%-104.65%和95.86%-106.69%,且对两种抗生素具有良好的特异性。