纤维素参与组成植物细胞壁,是地球上储量丰富的可再生碳资源,将纤维素转化为可发酵糖后转化为乙醇进行利用,被认为是取代人们对各种化石能源产品的依赖,解决能源危机最有前景的途径之一。在纤维素转化为可发酵糖的方法中,生物酶法相对化学法更加温和和环保。生物法水解纤维素有三种主要酶,分别是:外切-β-1,4-葡聚糖酶（CBH）、内切-β-1,4-葡聚糖酶（EG）及β-葡萄糖苷酶（BG）,三种纤维素酶能协同地水解纤维素,但其效率和使用成本限制了其在纤维素转化的工业化应用。本论文为此使用串联融合策略将三种纤维素酶融合为单基因多功能的纤维素酶,以期减少每种酶的使用成本和提高酶的协同水解效应从而提高水解效率。在本研究中,我们选择了三种不同来源的纤维素酶基因cbh、eg、bg,首先在毕赤酵母X33中异源表达了eg并对产生的EG进行了纯化,分析其与CBH对不同底物的催化能力。结果表明纯化的EG主要对羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和磷酸膨胀纤维素（PASC）有活性,对应底物酶活分别为:2.21 U/mg、0.16 U/mg。随后分析了EG与CBH对于不同纤维素底物CMC-Na、PASC、微晶纤维素（Avicel）的协同水解作用,结果表明在0.1 mg/m L EG单独对CMC-Na水解10 min时能产生36 mg/L还原糖,在0.1 mg/m L CBH单独对CMC-Na水解10 min时能产生23 mg/L还原糖,在酶浓度保持不变情况下,两种酶共同水解底物CMC-Na能产生100 mg/L还原糖,糖产量高于两种酶单独作用的还原糖之和59 mg/L;EG单独水解PASC和Avicel底物10 min时未检测出还原糖的产生,而和CBH混合作用这两种底物时,对PASC和Avicel产生的还原糖较CBH分别高出50 mg/L和60 mg/L,表明本研究所用CBH和EG具有较高协同效应,可用于构建杂合纤维素酶。三种纤维素酶串联杂合之后,因其不同的排列方式可能会影响酶的构象、间距和灵活性等因素,从而影响酶的表达量和活性,因此有必要探究三种纤维素酶的串联方式,找出最佳表达量和活性的杂合纤维素酶组合。于是我们通过同位酶酶切和T4酶连的方法将三种纤维素酶基因进行连接,得到六种组合杂合纤维素酶基因,分别命名为ceb、cbe、ecb、ebc、bce、bec。将融合基因克隆至表达载体p PICZαA,将构建好的六种排列的杂合纤维素酶基因电转至毕赤酵母X33并通过PCR验证融合基因转入成功,再将转化子挑至CMC-BMMY筛选平板进行功能筛选,选出了活性最高的杂合纤维素酶组合ecb,但摇瓶诱导表达的表达量过低,因此将该组合的杂合纤维素酶基因转入大肠杆菌大量表达,形成了包涵体,随后对大肠杆菌表达的诱导温度（14℃、16℃、18℃）和诱导剂浓度（1 m M、2 m M、4 m M）进行优化,仍未得到可溶性目的蛋白。将包涵体进行了稀释复性和透析复性并将复性后的蛋白进行酶活测试,结果表明仍未得到有活性的目的蛋白,还需进一步的研究。综上所述,本论文成功在毕赤酵母X33中表达了EG,确定了其与CBH的协同水解底物的作用。随后构建了基与于协同作用的六种组合的杂合纤维素酶表达载体,并在必须酵母X33成功转化。通过CMC-Na底物筛选平板成功筛选出了活性最高的ECB组杂合纤维素酶,对ECB在毕赤酵母和大肠杆菌中异源表达进行了尝试,为后续杂合纤维素酶的表达优化提供了基础。