论文部分内容阅读
在传统中药中,僵蚕Bombyx batryticatus和斑蝥都是虫源药物。僵蚕是蚕蛾科Bombycidae昆虫家蚕Bombyx mori.的幼虫感染或人工接种白僵菌Beauveria bassiana后僵死的干燥全虫。斑蝥是芫菁科Meloidae昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata或黄黑小斑蝥Mylabri cichorii的干燥体。传统医学研究和现代临床医学实践认为:僵蚕主要治疗咽喉肿痛、皮肤瘙痒、颌下淋巴炎、面神经麻痹和惊风抽搐等病症。斑蝥能够破除血瘀,消去肿块、治疗痈疽恶疮,斑蝥体内的活性物质斑蝥素(cantharidin)是一种倍半萜类物质,具有很好的抗癌活性。去甲斑蝥素(demethylcntharidin)具有与斑蝥素类似的生物活性。虽然僵蚕和斑蝥素及其衍生物已经在临床医学上有广泛的应用,但对于僵蚕提取物的抑菌活性尚无研究报道。本研究以僵蚕提取物和斑蝥素及其衍生物为实验材料,系统地研究其抑菌活性。取得的主要实验结果如下:1.僵蚕抑菌活性组分的提取工艺通过比较超声波提取法、微波提取法、煎煮提取法和冷浸提取法四种提取方法,以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇和水等7种提取溶剂对提取僵蚕浸膏率和抑菌成分的抑菌效果的比较,可以发现,僵蚕活性组分最优提取工艺为:采用超声波法,用95%的乙醇溶剂提取。2.僵蚕提取物的抑菌作用僵蚕醇提物浸膏生测结果表明:僵蚕醇提物对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae和肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis等细菌均有一定程度的抑制活性,僵蚕醇提物对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.10g/ml,对肺炎克雷氏伯菌的MIC为0.20 g/ml,对肺炎链球菌的MIC为0.40g/ml,对肠炎沙门氏菌的MIC为0.40g/ml。采用菌丝生长速率法,测定了僵蚕醇提物对35种植物病原真菌的抑制作用,实验结果表明:僵蚕醇提物对苹果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、苹果腐烂病菌Valsa mail和花椒落叶病菌Marssonina zanthoxyli的半数有效浓度(EC50)分别为0.048g/ml、0.099g/ml和0.078g/ml。对其它测试的植物病原真菌则没有抑菌作用,如:棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和番茄早疫病菌Alternaria solani等。僵蚕醇提物浸膏用石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取,得到石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4种不同的萃取成分,最后进行抑菌实验。抑菌实验结果表明:0.50g/ml正丁醇萃取物对各细菌的抑制作用较强,其中对肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis抑菌作用最强,抑菌圈直径(DIZ)达到了10.75±0.50mm,而石油醚萃取物对供试的几种细菌菌没有发现抑制作用。采用硅胶柱层析技术对僵蚕醇提物的氯仿萃取成分及正丁醇萃取成分进行进一步的分离纯化和抑菌实验,实验结果显示:氯仿萃取成分经硅胶柱层析分离后,收集的流分中抑菌作用最强的是50%乙醇(乙醇:水=1:1)洗脱的流分。1mg/ml 50%乙醇(乙醇:水=1:1)洗脱的流分对乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphib和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的抑菌圈直径均达到了10.50±0.03mm。而正丁醇萃取成分经硅胶柱层析分离后,收集的流分中抑菌作用最强的成分是由洗脱剂为丙酮:石油醚=2:1冲洗的流分。1mg/ml该流分对枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis的抑菌活性最强,抑菌圈直径达到了6.10±0.02mm,其次为对肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae、大肠杆菌Escherichia coli和乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphib的抑菌活性,抑菌圈直径分别为4.90±0.10mm、4.60±0.03mm和4.40±0.05mm。3.斑蝥素及其衍生物的抑菌作用斑蝥素及去甲斑蝥素对11种植物病原真菌的抑菌活性研究发现,斑蝥素及去甲斑蝥素对不同植物病原真菌表现出不同程度的抑制作用。斑蝥素对棉花立枯病菌Rhizoctonia solani和桃腐烂病菌Valsa leucostoma的抑制作用较强,半数有效浓度EC50(effective concentration)分别为2.489mg/l和3.716mg/l。经扫描电镜观察斑蝥素及去甲斑蝥素处理对桃腐烂菌丝形态的影响发现,经100mg/l去甲斑蝥素处理后,桃腐烂病菌Valsa leucostoma菌丝变粗,发生不规则的膨胀现象,100mg/l斑蝥素处理的桃腐烂菌丝表面皱缩、萎蔫,而丙酮对照的菌丝表面光滑、纤细。