研究背景:食管癌(esophagus cancer,EC)在世界范围内的肿瘤发病率中排第八位。EC主要包括两种组织学类型,鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,AC)。在亚洲地区主要以食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)为主。ESCC的发生是遗传因素和环境因素相互作用的结果,其中环境因素包括饮食习惯,吸烟饮酒,还有潜在病毒感染可能。感染是一种致癌因素,2008年全球范围内由感染引起的肿瘤占总发病率的16.1%,其中包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)总共引发了 1900,000万的新发肿瘤。而人乳头瘤病毒是其中重要的一种致癌病毒,其引起了 4.8%的新发肿瘤。90%的宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)与 HPV 感染有关,另外有一些非生殖器肿瘤的发生也与HPV病毒感染相关,如口咽鳞状细胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinomas,OSCC)。OSCC 中有一类无吸烟饮酒史的亚群,HPV感染是其肿瘤发生的致癌因素。最新研究报道,HPV感染或许与食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)的发生有关系:在EAC中检出HPV的阳性率为66.7%,且与疾病的严重程度相关。在人的一生中有80%的可能性感染HPV,然而仅有高危型HPV(high risk HPV,hr-HPV)会引起恶性肿瘤的发生。高危HPV的主要型别有HPV16,18,33,58等,而宫颈鳞癌和口咽鳞癌主要由HPV16,18引起,占70%。Hr-HPV的致癌活性是基于其致癌蛋白E6/E7的作用,它们重新激活了不可再生细胞的DNA合成,抑制细胞死亡,阻碍细胞分化。ESCC与CSCC,OSCC有着共同的组织学类型均来源于鳞状上皮,且食管与口咽部毗邻,高危型HPV在食管鳞癌的感染率和肿瘤发生发展的关系是食管癌研究的热点之一。认为HPV感染与ESCC发生发展没有关系的研究证据有:HPV在食管癌组织中的检出率差异巨大(0～78%),且大部分研究得到的是阴性结果,血清学危险度的评价也不一致;HPV病毒颗粒广泛存在于环境中,操作不当和交叉污染都很可能引起假阳性;且HPV感染深部脏器的途径和机理仍局限于体外实验。认为两者相关的证据有:在动物模型中,牛乳头瘤病毒能诱发生的食管癌变;与食管毗邻的口咽部肿瘤已被证实与HPV感染相关联,病毒可以通过下行感染食管;HPV感染的食管细胞形态学改变与尖锐湿疣细胞相似;食管癌患者血清中存在HPV的抗体,检出率高于健康人群。另外,还有研究显示,在食管癌的高发区,HPV的感染率明显更高,即使其病毒拷贝数仍低于宫颈癌中的病毒拷贝数。然而,hr-HPV在食管癌中的感染率以及其与食管癌发生发展的关系仍不清楚。目前HPV的检测方法的研究主要从DNA水平通过PCR和ISH的方法进行检测,以PCR为代表的扩增法是检测样本中HPV基因片段运用最广泛、最有效的技术,但容易因为污染造成假阳性,且敏感度不够难以检测到<10拷贝/每个细胞的病毒载量。检测HPV E6/E7 mRNA被认为是在肿瘤中检测HPV感染的“金标准”。本研究采用了一种新的RNA原位杂交方法——RNAscope技术,其探针设计特点结合病毒转录产生mRNA的过程提供了一个天然的信号放大过程,有助于临床样本中的病毒检测。此外,由于检测的是样本细胞中具有转录活性的HPVmRNA,因此,可以最大程度的减少操作过程中引入环境中HPVDNA导致样本污染而产生假阳性的结果。此外,我们还在相同的组织样本上观测到阳性p16信号。p16在宫颈癌和口咽癌中被认为是HPV感染的替代标志。与检测HPV DNA的方法相比,在宫颈癌筛查中利用p16 IHC进行检测被认为具有相近或更高的特异性和敏感性。病毒的感染会对人体健康造成深远的影响并在人体免疫系统留下不可磨灭的痕迹。血清学相较于核酸检测方法的优势体现在能得到曾经进入人体并对组织造成损伤后被机体免疫机制清除的那部分病毒感染证据;另一方面,可以避免当病毒感染的丰度较低或在体液或体表时所得到的假阴性结果,可以提供病原体当前以及既往感染的充分证据。研究目的:HPV感染在食管鳞癌发生发展中的作用仍不清楚,早前的研究结果不完全一致存在许多争议。本研究采用新的RNA原位杂交技术联合HPV16/18 E6、p16INK4a蛋白免疫组化染色在一个较大的人群中回顾性的探索具有生物学活性的hr-HPV在食管鳞癌中的感染情况,并分析病毒感染对食管鳞癌临床特征和预后的影响,为食管癌的精准医疗提供临床研究证据。另一方面,我们针对食管鳞癌中感染率最高的HPV16的致癌蛋白E6/E7血清抗体采用新的血清学方法——多肽芯片扫描技术在一个较大的人群中进行筛查,并识别了 HPV16 E6/E7对应的B细胞抗原表位,从机体免疫反应的角度探索HPV在食管鳞癌中的感染情况,进一步研究治疗性HPV疫苗提供了研究基础。材料和方法:收集504例确诊为ESCC病人的手术切除的癌组织和癌旁上皮,在这一人群中同时采用三种检测方法评估hr-HPV的致癌活性,包括hr-HPV E6癌蛋白mRNA原位杂交实验、HPV16/18 E6致癌蛋白和HPV致癌活性替代标志物p16INK4a蛋白的免疫组织化学染色。对31例宫颈癌,7例口咽癌的癌组织与癌旁上皮进行了 hr-HPV E6 mRNA原位杂交检测。对组织中hr-HPVE6 mRNA进行量化,基于40×镜下的观察,我们建立了RNA原位杂交的定量方法,即计算每个有效视野中的拷贝数,0～2个拷贝/视野我们认为是阴性(-),2～20个拷贝/视野认为是模棱两可的结果(-/+),20～40个拷贝/视野为阳性(+),40～个拷贝/视野为强阳性(++)。研究HPV感染对食管鳞癌临床特征影响,采用SPSS19.0对临床信息进行统计学分析。Kaplan-Meier法计算hr-HPV感染状态对ESCC病人生存预后的影响,两组生存率比较用Log-rank检验,Cox比例风险模型评估HPV感染对食管鳞癌发展风险评估;不同HPV感染程度ESCC肿瘤患者的肿瘤分化程度,大小,临床分期等临床特征的差异采用χ2检验;Hr-HPVE6mRNA水平与p16蛋白表达的相关性采用相关分析;采用t检验对HPV相关肿瘤中hr-HPV感染情况及病毒拷贝数进行统计检验。另一方面,对120例食管鳞癌病人术前血清,20例年龄性别匹配的健康人,20例宫颈癌术前血清,20例口咽癌血清以10人混合血清池为单位进行多肽阵列扫描技术进行HPV16 E6/E7抗体进行初筛,并识别相应的B细胞抗原表位。将筛选出的抗原表位结合生物信息学分析,得到可靠的5个抗原表位。进一步使用多肽芯片技术在更大的人群中单例筛查食管鳞癌人群(100例)和健康人群(81例)血清中进行筛查HPV16 E6/E7的抗体水平。研究结果:我们在ESCC人群的肿瘤组织中存在具有转录活性的hr-HPV E6 mRNA,阳性信号大部分呈现直径小于1.5μm的深咖啡色“点状”,小部分直径大于1.5μm,呈“片状”分布。在ESCC细胞中,hr-HPV E6 mRNA散在分布在细胞浆和胞核中。在其相邻的上皮组织中,hr-HPV E6 mRNA集中分布在增殖能力较强的基底层细胞中。ESCC组织中hr-HPV E6 mRNA信号强度的分层,以20信号/视野为分界线,大于20的(+~++)认为是阳性。ESCC人群中hr-HPV阳性比例为26.52%(96/362),癌旁上皮的阳性率为17.22%(52/302),hr-HPVE6mRNA在肿瘤组织中的阳性率显著高于癌旁上皮。在ESCC肿瘤组织和癌旁上皮中均检测到了 hr-HPVE6蛋白的表达,癌组织中的表达水平高于癌旁上皮,且在癌旁上皮中主要表达于基底层细胞,这与hr-HPVE6mRNA的分布情况相似。hr-HPV16/18 E6在ESCC人群肿瘤组织中的阳性率为44.9%(142/316),在癌旁上皮中阳性率为32.9%(77/234),P=0.005。ESCC肿瘤组织样本p16IN4a蛋白染色阳性率为13.6%(46/338),癌旁上皮中的阳性率为3.7%(12/321)且p16INK4a的表达水平与 hr-HPV 16/18 E6mRNA 呈正相关(P 0.018)。hr-HPV 16/18 E6mRNA阳性(+～++,中位生存时间37.86个月)的总生存期显著高于hr-HPV 16/18 E6 mRNA阴性(-,中位生存时间为21.78个月,P=0.002)。表达HPV16/18E6致癌蛋白的人(>5,中位生存时间38.23)的总生存期要显著高于HPV16/18 E6致癌蛋白阴性人群(<5,中位生存时间21.32)P=0.045。hr-HPV 16/18 E6mRNA和p16INK4a双阳性人群总生存期(中位生存时间:53.97)显著高于双阴性的人群(中位生存时间:22.38)P=0.041。进一步对hr-HPVE6mRNA(-/+)人群的HPV感染情况进行研究,联合了 HPV 16/18 E6和p16INK4a这两种指标进行分析,hr-HPV(RNA(+)PLUS,37/208,中位生存时间:52.12),与三种指标都为阴性(Triple Negative,34/208,中位生存时间:18.89)的人群比较,RNA(+)PLUS 总生存率显著高于 Triple Negative(P=0.005.)与 hr-HPV E6 mRNA 阴性的人群比较,hr-HPVE6mRNA高表达的肿瘤组织分化程度更低(P<0.001);HPV16/18 E6蛋白阳性组和阴性组进行对比,阳性组的分化程度较差(P<0.001)且肿瘤大小偏小(P<0.001)。ESCC与CC和OSCC相比,hr-HPV E6 mRNA原位杂交信号强度要弱,拷贝数是CC的1/20。多肽扫描初筛结果ESCC人群中HPV16 E6/E7抗体水平高于健康人群,同时筛选出了 5个抗原表位3个来自HPV16 E6癌蛋白(SLYGTTLEQQYNKP,CQKPLCPEEK,IRGRWT),2 个来自 HPV16E7 癌蛋白(TLHEYMLDLQPETT,SSEEEDEIDG)。其中抗原性最强的分别是HPV16 E6的CQKPLCPEEK和HPV16 E7的TLHEYMLDLQPETT。应用生物信息学方法对抗原表位理化性质分析结果显示,筛选出的抗原表位符合抗原表位存在的理化性质的合理区域。在多肽芯片技术扩大筛查人群,得到ESCC人群中HPV16 E6/E7抗体的阳性率为29%(29/100),健康对照中的阳性率为13.58%(11/81)(P=0.019),且每一个表位的平均SNR值也高于健康对照。结论:我们发现有一类ESCC人群中存在hr-HPV的感染,在其肿瘤组织中可以检测到hr-HPV E6 mRNA的表达且具有良好的预后。对HPV致癌蛋白的抗原表位的识别是hr-HPV E6 mRNA阳性ESCC亚型的一种治疗基础。ESCC人群中有致癌风险的HPV16感染率显著高于年龄性别匹配的健康人群;实验筛选出了E6/E7的5个符合理化性质的抗原表位,可以为将来的治疗性抗体提供实验理论基础。主要创新点:原位检测在ESCC的肿瘤组织和癌旁上皮中有转录活性的hr-HPV感染情况。有转录活性的hr-HPV感染的ESCC病人有更好的疾病转归,更长的生存期。在HPV相关的肿瘤中同时进行了 hr-HPV mRNA的检测,比较了其信号强弱和拷贝数的差异。在ESCC人群中筛查了 HPV16E6/E7蛋白的抗体,并得到了其对应的B细胞线性抗原表位。