第一部分:血浆二胺氧化酶(DAO)在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌患者中的表达规律研究研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染可导致肝脏炎症,长期反复炎症可导致肝硬化和肝细胞癌的发生,称为乙肝病毒感染的“三部曲”。肝衰竭可发生在慢性HBV感染的不同阶段,起病凶险,死亡率高,临床缺乏有效治疗手段。肝脏和肠道解剖关系密切,通过“肠-肝轴”相互影响。肠道是维持微生态和防止病原体入侵的重要屏障,肠道消化吸收的物质首先通过门静脉转运至肝脏,当肠道屏障功能受损、肠壁通透性增加时,肝脏更容易暴露于肠道内微生物及其代谢产物,加重肝脏原有损伤。血浆二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)水平是目前最常用的反映肠道屏障功能和肠壁通透性的分子指标,然而我们尚不清楚慢性HBV感染不同阶段的DAO表达规律,以及血浆DAO水平与疾病进展和预后的关系。因此,研究血浆DAO水平在慢性HBV感染不同阶段患者中的动态变化规律,具有重要的临床意义。研究目的1、明确慢性乙型肝炎、肝硬化(代偿期和失代偿期)和肝细胞癌患者的血浆DAO水平变化规律,阐明血浆DAO与临床指标的相关性;2、阐明血浆DAO水平作为分子标志物预测失代偿期肝硬化住院患者6个月内再入院的诊断价值。研究方法本研究首先采用横断面研究设计,纳入慢性乙型肝炎患者70例、肝硬化患者255例(其中代偿期120例、失代偿期135例)、肝细胞癌患者40例以及健康对照者12例,ELISA方法检测血浆DAO水平,比较不同组别患者的血浆DAO差别。分类变量采用卡方检验,连续变量采用Mann-Whitney U检验和秩和检验,Spearman相关分析方法分析DAO与临床和实验数据的相关性。所有135例失代偿期肝硬化患者均为住院患者,采用前瞻性研究设计,以是否再入院为观察终点,通过电话及住院系统进行随访,随访时间不少于6个月,计算6个月内再入院率。以6个月内是否再入院为因变量,首先采用单因素Cox回归分析筛查失代偿期肝硬化患者再入院的风险因素,然后将P<0.05的变量纳入多因素Cox回归分析,确定失代偿期肝硬化患者再入院的独立风险因素。采用ROC曲线评价血浆DAO水平预测失代偿性期肝硬化6个月内再入院的诊断价值。采用Kaplan-Meier法比较不同分界点的累积再入院时间差别。双侧P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1、慢性乙型肝炎患者血浆DAO水平明显高于健康对照者[4.9(3.3,6.9)vs.1.6(1.4,2.0)ng/mL,P<0.001];肝硬化患者血浆DAO水平明显高于慢性乙型肝炎患者[11.8(7.9,17.7”s.4.9(3.3,6.9)ng/mL,P<0.05];肝细胞癌患者血浆DAO 水平明显高于肝硬化患者[18.3(13.4,20.5)vs.11.8(7.9,17.7)ng/mL,P<0.001]和慢性乙型肝炎患者[18.3(13.4,20.5)vs.4.9(3.3,6.9)ng/mL,P<0.001]。2、慢性乙型肝炎患者中,HBeAg 阳性组(n=49)血浆DAO水平[5.0(3.8,7.3)ng/mL]与 HBeAg 阴性组[n=21,4.9(2.7,6.3)ng/mL]无明显差别(P>0.05),HBV-DNA 阳性组(n=58)血浆 DAO 水平[4.9(3.1,6.9)ng/mL]和 HBV-DNA 阴性组[n=12,6.3(4.4,6.9)ng/mL]无明显差别(P>0.05)。相关分析提示,血浆DAO水平与谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和血浆总胆红素(TBIL)呈明显正相关(ALT,r=0.530,P<0.001;AST,r=0.483,P<0.001;TBIL,r=0.313,P<0.05),与HBsAg定量、白蛋白(ALB)、凝血酶原活动度(PTA)、年龄和性别无明显相关(均P>0.05)。3、肝硬化患者中,失代偿期肝硬化患者(n=I 35)血浆DAO水平[14.6(10.4,20.3)ng/mL]明显高于代偿期肝硬化患者[n=120,9.4(6.2,13.5)ng/mL,P<0.001]。Child-pugh评分C级患者(n=45)血浆DAO水平[22.4(16.5,29.1)ng/mL]明显高于 B 级患者[n=138,12.6(9.3,16.4)ng/mL,P<0.001],B 级患者的血浆 DAO水平明显高于A级患者[n=72,7.8(5.4,9.9)ng/mL,P<0.001]。肝硬化患者中,腹水组(n=112)与无腹水组(n=143)血浆DAO水平无明显差别(户>0.05),消化道出血患者组(n=27)DAO水平[20.9(11.6,30.3)ng/mL]明显高于无消化道出血患者组[n=228,11.4(7.9,16.9)ng/mL,P<0.05],自发性细菌性腹膜炎患者组(n=21)血浆DAO水平[21.3(17.6,42.6)ng/mL]明显高于无自发性腹膜炎患者组[n=234,11.1(7.8,16.4)ng/mL,P<0.05],肝性脑病患者组(n=18)血浆 DAO水平[19.0(16.3,27.1)ng/mL]明显高于无肝性脑病患者组[n=237,11.3(7.8,17.0)ng/mL,P<0.05]。血浆 DAO 水平与 AST、TBIL 呈明显正相关(r=0.14,P=0.026;r=0.574,P=0.000),与 ALB 水平呈明显负相关(r=-0.230,P=).000)。4、135例失代偿期肝硬化患者随访6个月,有36例因肝脏相关疾病再次入院,再入院率为26.7%。单因素Cox模型分析结果显示,血浆DAO水平(HR=1.126,95%CI:1.068-1.188,P<0.001),Child-pugh 评分(HR=3.700,95%CI:1.665-8.223,P<0.05),消化道出血(HR=5.179,95%CI:2.113-12.690,P<0.001),肝性脑病(HR=4.375,95%CI:1.567-12.215,P<0.001),自发性细菌性腹膜炎(HR=3.077,95%CI:1.176-8.049,P<0.001)和血红蛋白(HR=0.979,95%CI:0.963-0.995,P<0.05)是影响失代偿期肝硬化患者6个月内再入院的有意义风险因素。多因素Cox 比例风险模型分析,结果显示血浆DAO水平(HR=1.102,95%CI:1.023-1.188,P<0.05)和肝性脑病(HR=5.018,95%CI:1.436-17.533,P<0.05)是失代偿期乙肝肝硬化患者6个月内再入院的独立风险因素。5、血浆DAO水平预测失代偿期肝硬化患者6个月内再入院的受试者工作特征曲线下面积(AUROC)为 0.769(SE 0.0457,95%CI:0.689-0.837),显著优于 HE[0.598(SE 0.0403,95%CI:0.511-0.682),P<0.05]和 Child-Pugh 评分[0.652(SE 0.0474,95%CI:0.565-0.731),P<0.05]。当血浆 DAO=19.7ng/mL 时,诊断敏感性为58.33%,特异性为84.35%。DAO>19.7ng/mL患者组6个月内再入院率明显高于 DAO≤19.7ng/mL 患者组[(58.3%(21/36)vs.15.2%(15/99),P<0.05]。Kaplan-Meier 分析提示,按照血浆 DAO≤19.7ng/mL 和>19.7ng/mL 分组,两组间的累积再入院时间有显著统计学差异(P<0.05)。6、肝细胞癌患者中,肿瘤大小>3cm的HCC患者血浆DAO水平明显高于≤3cm 的患者[20.0(18.3,23.1)vs.13.6(12.3,14.8)ng/mL,P<0.001]。TNM分期Ⅲ/Ⅳ的HCC患者的血浆DAO 水平明显高于Ⅰ/Ⅱ 的患者[20.0(18.5,24.0)vs.14.2(12.3,19.1)ng/mL,P<0.05];血浆DAO水平与AFP水平呈明显正相关(r=0.582,P<0.001),而与患者性别、年龄、有无肝硬化、肿瘤的数量以及HBeAg 状态、ALT、AST、TBIL、ALB、PTA 无明显相关性。结论慢性HBV感染患者血浆DAO水平较健康对照者明显升高,随病情进展,DAO水平逐渐升高,提示肠道通透性参与慢性HBV感染疾病进程。慢性乙型肝炎患者血浆DAO水平与肝功能指标密切相关;肝硬化患者血浆DAO水平与病情严重程度及并发症密切相关,血浆DAO水平是失代偿期肝硬化患者6个月再入院的独立风险因素,可作为分子标志物预测失代偿期肝硬化6个月内再入院;肝癌患者血浆DAO水平与肿瘤的大小及TNM分期相关。第二部分:血浆二胺氧化酶(DAO)作为分子标志物评估慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者预后的诊断价值研究研究背景慢加急性乙型肝炎衰竭(Acute-on-Chronic Hepatitis B liver Failure,ACHBLF)是指在慢性乙型肝炎病毒感染基础上,在4周内发生肝功能迅速恶化而引起的肝衰竭,主要表现为肝功能失代偿和凝血功能障碍。ACHBLF发病急骤,病情凶险,死亡率高,临床缺乏特异性治疗手段,约50-90%的患者在1个月内即可发生死亡,抢救肝衰竭患者成功的关键在于早期诊断和早期治疗,以及精准预测肝衰竭的发展和临床预后。因此,寻找肝衰竭预后的有效、敏感和特异的分子标志物是肝衰竭领域的研究热点之一。终末期肝病模型(Model for End-stage Liver Diseases,MELD)是目前常用预测肝衰竭预后的评分系统,用于评估终末期肝病的病情严重程度。然而,MELD评分并不完全适合我国ACHBLF患者的临床特点,在预测ACHBLF死亡率等方面的敏感性和特异性均存在较大偏差。二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)是反映肠道屏障功能和肠壁通透性的快速敏感的生物标志物。我们在第一部分研究中,发现血浆DAO水平与慢性HBV感染的疾病进程相关。同时,血浆DAO水平还可以作为有效的分子标志物预测失代偿期肝硬化患者6个月内的再入院情况,因此,我们推测血浆DAO可能也参与了肝衰竭的疾病进程,并与肝衰竭疾病预后相关。在这部分内容中,我们检测了 ACHBLF患者血浆DAO水平,并评估了血浆DAO作为分子标记物预测ACHBLF患者1个月死亡率的诊断价值。研究目的1、研究ACHBLF患者血浆DAO表达规律以及与病情严重程度的关系;2、评估血浆DAO水平作为分子标志物预测ACHBLF患者1个月死亡率的诊断价值。研究方法选择2014年1月至2016年10月期间山东大学齐鲁医院肝病科住院患者,按照入选标准和排除标准,共纳入ACHBLF患者106例,进入前瞻性研究队列,以肝衰竭死亡事件为随访终点,随访时间不少于1个月。采用ELISA方法检测患者血浆DAO水平。分类变量比较采用卡方检验,连续变量比较采用Mann-Whitney U检验和秩和检验,两变量间相关性分析采用Spearman相关分析方法分析。单因素Logistic回归分析筛选ACHBLF患者1个月死亡率的风险因素,将P<0.05的变量纳入多因素logistic回归分析,明确血浆DAO水平是否ACHBLF患者1个月死亡率的独立风险因素。为了评估血浆DAO水平能否增加MELD积分对肝衰竭预后的诊断价值,我们利用二元Logistic回归方程建立了血浆DAO水平和MELD积分的联合诊断模型:变量(血浆DAO联合MELD积分)=0.642×MELD+0.056×DAO-16.671。采用 ROC 曲线评估 DAO、MELD积分、DAO联合MELD积分模型对ACHBLF患者1个月死亡率的诊断准确性,采用Kaplan-Meier方法比较不同变量按截断值分组的累积生存时间。双侧P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1、共纳入ACHBLF患者106例,随访结束时共有66例患者死亡,死亡率62.3%。死亡组患者 TBIL水平[305(262,385)vs.196(151,248)μmol/L,P<0.001]、MELD 评分[27.3(24.8,32.3)vs.22.0(20.7,26.5),P<0.001]、INR[2.5(2.1,3.7)vs.1.9(1.8,2.1),P<0.01]明显高于生存组患者,死亡组患者 ALB[32.3(30.0,34.7)vs.34.2(31.6,37.4)g/L,P<0.05]、PTA[30(18,33)vs.38(32,39),P<0.05]、AFP[56(39,88)vs.156(104,416)ng/mL,P<0.001]>PLT[129(100,150)vs.132(111,173)×109/L,P<0.05]明显低于生存组患者。死亡组患者的腹水(60.6%vs.17.5,P<0.001)、SBP(54.5%vs.5%,P<0.001)和HE(57.6%vs.12.5%,P<0.001)的发生率明显高于生存组。死亡组和生存组患者的HBV-DNA状态、HBsAg定量、HBeAg状态、ALT、AST、WBC、HGB、Na 和 Cr 无明显差别(均 P>0.05)。2、生存组患者组血浆DAO水平[14.0(7.1,26.5)ng/mL]明显低于死亡组患者[58.6(32.5,121.3)ng/mL,P<0.001]。3、ACHBLF 患者血浆 DAO 水平与 TBIL(r=0.507,P<0.001)、INR(r=0.518,P<0.001)和 MELD 积分(r=0.578,P<0.001)呈明显正相关,与 PTA(r=-0.511,P<0.001)、AFP(r=-0.412,P<0.001)和 HGB(r=-0.231,P=0.017)呈明显负相关。血浆DAO水平与年龄、HBsAg定量、HBeAg状态、HBV-DNA状态、ALT、AST、ALB、Cr、WBC和PLT无明显相关(均P>0.05)。4、单因素Logistic回归分析提示,MELD评分(OR=1.838,P<0.001)、血浆 DAO 水平(OR=1.055,P<0.001)、ALB(OR=0.886,P<0.05)、PLT(OR=0.985,P<0.05)、腹水(OR=7.731,P<0.001)、SBP(OR=22.800,P<0.05)和HE(OR=9.500,P<0.05)是影响ACHBLF患者1个月预后的风险因素。5、多因素logistic回归分析提示,血浆DAO水平(OR=1.053,P<0.05)、HE(OR=7.678,P<0.05)、SBP(OR=15.91,P<0.05)和 MELD 评分(OR=1.680,P<0.05)是影响ACHBLF患者1个月预后的独立风险因素。6、血浆DAO水平用于诊断ACHBLF患者1个月死亡率的ROC曲线下面积(AUROC)为 0.880(SE 0.0329,95%CI:0.803-0.935),MELD 积分的 AUROC为 0.843(SE 0.0391,95%CI:0.760-0.907),两者之间无统计学意义(P=0.43)。DAO 联合 MELD 积分的 AUROC 为 0.916(SE 0.0256,95%CI:0.846-0.961),明显高于MELD积分和血浆DAO(均P<0.05)。7、当选择血浆DAO水平的最佳截断值15.2ng/mL 时,诊断敏感性为95.45%,特异性为62.5%;当选择MELD积分的最佳截断值22.6时,诊断敏感性为90.91%,特异性为67.5%;当选择DAO联合MELD积分联合诊断模型的最佳截断值为0.07时,诊断敏感性为87.88%,特异性为80%。Kaplan-Meier方法提示,按照血浆 DAO≤15.2ng/mL 和>15.2ng/mL 分组,MELD≤22.6 和>22.6分组,DAO联合MELD诊断模型≤0.07和>0.07分别分组,各组间的累积生存生存时间有显著统计学差异(均P<0.001)。结论血浆DAO水平与ACHBLF患者的病情严重程度相关,可作为独立的分子标志物预测ACHBLF患者1个月预后。同时,血浆DAO可增加MELD积分预测ACHBLF患者1个月预后的诊断价值。第三部分:慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期患者血浆二胺氧化酶(DAO)与肠道菌群相关性的初步探讨研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF)进展迅速,死亡率高,临床救治成功的关键在于早期诊断和早期治疗。近年来逐渐认识到,在未发生肝衰竭的慢性HBV感染患者中提前预测具有肝衰竭风险的患者,促进“诊断节点”前移,对于降低肝衰竭的发病率具有重要意义。因此,国内外学者提出了“肝衰竭前期”的概念,即在慢性HBV感染患者中,选择具有高胆红素血症和凝血功能障碍但还未达到肝衰竭诊断标准的阶段,作为“肝衰竭前期”,给予临床重点监测和治疗。根据亚太肝病学会的诊断标准,慢加急性乙型肝炎肝衰竭前期(Acute-on-Chronic Hepatitis B pre-Liver Failure,pre-ACHBLF)是指慢性乙型肝炎进展至肝衰竭过程中的前期阶段,以血清总胆红素(TBIL)≥85umol/L且凝血酶原活动度(PTA)>40%为特征。在第二部分的研究中,我们发现血浆二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)水平可反映ACHBLF患者的病情严重程度,ACHBLF患者存在肠道通透性增加。然而,我们并不清楚处于pre-ACHBLF阶段的患者,是否存在血浆DAO水平的变化及肠道菌群的变化,肠道菌群的变化规律如何,以及血浆DAO 水平的表达规律和肠道菌群的关系。因此,我们通过收集pre-ACHBLF患者的血浆和粪便样本,观察血浆DAO的表达规律,通过高通量测序方法检测粪便样本肠道菌群的变化规律,阐明Pre-ACHBLF患者血浆DAO的与肠道菌群的相关性。研究目的1、研究pre-ACHBLF患者血浆DAO水平及与临床指标的相关性;2、研究pre-ACHBLF患者肠道菌群的改变;3、研究pre-ACHBLF患者血浆DAO水平与肠道菌群的相关性。研究方法本研究采用病例对照研究设计,共纳入pre-ACHBLF患者31例,年龄和性别匹配的健康对照26例。采用ELISA方法检测血浆DAO水平,Spearman相关分析研究DAO水平与临床指标的相关性。采集患者和健康对照者的粪便样本,16S rRNA测序检测肠道菌群的分布规律,微生物多样性分析、NMDS分析和物种组成差异分析研究肠道菌群的规律。Spearman相关分析研究血浆DAO水平与临床指标及差异菌群的相关性。双侧P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1、pre-ACHBLF患者血浆DAO水平明显高于健康对照组[31.7(22.1,43.2)vs.1.7(1.4,2.2)ng/mL,P<0.001]。pre-ACHBLF 患者血浆 DAO 水平与 TBIL水平(r=0.672,P=0.000)和AST水平(r=0.369,P=0.041)呈明显正相关,与ALB水平呈明显负相关(r=-0.548,P=0.001),与ALT水平、PTA水平、MELD评分、年龄、HBsAg定量、HBeAg状态、HBV-DNA状态、肌酐(Cr)、白细胞(WBC)和血小板(PLT)之间无显著相关(均P>0.05)。2、57例粪便标本共获得5,101,887条测序序列,所有序列按97%的相似性聚类,所有样本共聚类得到916个分类操作单元(Operational Taxonomic Units,OTUs),其中两组共有的OTU为501个,健康对照组特有的OTU为358个,pre-ACHBLF 特有的 OTU 为 57 个。3、与健康对照相比,Pre-ACHBLF患者:菌群多样性指数包括shannon指数明显降低(P<0.01)和simpson指数显著降低(P<0.01);菌群丰度指数包括Chaol指数显著降低(P<0.01)和ACE指数显著降低(P<0.01)。4、微生物群落非度量多维尺度分析(NMDS)分析提示pre-ACHLBF组和健康对照组可以比较容易的区分开来,应力函数值(stress)为0.161。样品组间差异显著性检测(Anosim)结果提示,pre-ACHBLF组和健康对照组的组间差异大于组内差异(R=0.3873,P=0.001)。5、在门的水平上,与健康对照组相比,pre-ACHBLF组厚壁菌门相对丰度降低(0.544 vs.0.641,P=0.035),变形菌门相对丰度增加(0.163 vs.0.069,P=0.008)。6、在属水平上,与健康对照组相比,我们共筛选出19个丰度有差异的菌属,其中pre-ACHBLF显著缺失的有11种,pre-ACHBLF菌群丰度增加的属有8种。7、血浆DAO水平与韦荣球菌(Veillonella)相对丰度呈正相关(r=0.665,P=0.000);与链球菌(Streptococcus)相对丰度呈正相关(r=0.436,P=0.014。结论Pre-ACHBLF患者血浆DAO水平比健康对照组明显升高,与病情严重程度密切相关。Pre-ACHBLF患者存在肠道菌群结构和丰度的改变,异常富集的韦荣球菌、链球菌与血浆DAO水平关系密切。