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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)是人类感染的重要致病菌,可引起多种感染性疾病。近年来,金葡菌耐药性问题日益严峻,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的出现及传播,给临床抗感染治疗带来了新的挑战。万古霉素作为临床上治疗MRSA感染的“最后防线”,金葡菌的万古霉素耐药性一直倍受关注。1997年日本首次报道了万古霉素中等耐药金葡菌(vancomycin-intermediate S.aureus,VISA)。2017年2月,WHO将VISA列为12类影响人类健康的最危险“超级细菌”之一。深入阐明VISA耐药的发生机制,对建立控制VISA感染的新策略具有重要现实意义。研究表明,VISA的形成机制复杂。通过VISA与其同源敏感菌VSSA(vancomycin-susceptible S.aureus)的全基因组测序及比较分析发现数十种基因的突变与VISA形成相关,且这些突变具有累积效应。其中,报道最多的突变发生在金葡菌二元调控系统(Two-component system,TCS)的编码基因上,如walKR,vraSR,graSR等。walKR是金葡菌必须的TCS,主要调控细胞壁的代谢。vraSR TCS能够快速响应金葡菌肽聚糖的损伤信号,增强其对抗生素的耐药性。graSR是一种糖肽类抗生素抗性相关的TCS,同样能够调控细胞合成相关基因的表达。有意义的是,VISA菌株除了万古霉素中等耐药表型外,还有细胞壁增厚、自溶能力降低等共同表型。不同的突变基因导致VISA共同表型出现的分子机制一直不清。我们前期分离、鉴定了一株VISA菌XN108(MIC=12?μg/ml),并进行了全基因组测序。本研究中,我们对XN108进行了比较基因组学分析,发现了可能与其万古霉素耐药性有关的突变位点;采用基因替换、基因敲除等方法对这些突变位点的功能进行了研究;进一步通过转录组、代谢组学等研究,揭示了CcpA-GlmS代谢调控轴在VISA菌株形成中的作用与机制。主要研究内容和结果如下:1.WalK(S221P)突变介导XN108中等耐受万古霉素的作用与机制将XN108与标准VSSA菌株TW20的基因组进行比较,发现WalK(S221P),GraS(T136I)和RpoB(H481N)三个点突变可能与XN108发生万古霉素中等耐药有关。其中,WalK(S221P)是一个新的突变位点。我们将VSSA菌株N315中的WalK编码基因突变为WalK(S221P),结果万古霉素MIC从1.5??μg/ml升高到8??μg/ml;而将XN108中的WalK(S221P)用N315中的WalK(P221S)替换后,其万古霉素MIC从12??μg/ml下降为4??μg/ml。电镜观测发现突变菌株的细胞壁也发生变化。自溶实验证实突变菌的自溶能力也发生改变。通过建立体外磷酸化反应体系,证实WalK(S221P)的自磷酸化水平较野生型WalK显著下降,导致其激活WalR调控靶基因的能力下降。这些结果表明,WalK(S221P)在介导XN108耐药性中发挥重要作用,其机制可能与WalK(S221P)突变后自磷酸化水平下降有关。2.WalK(S221P)和GraS(T136I)协同介导XN108对万古霉素中等耐药表型对XN108中的WalK(S221P),GraS(T136I)和RpoB(H481N)三个突变位点进行逐步回复,成功构建XN108-WalK(P221S)(命名为K65),XN108-GraS(I136T)(命名为S65),XN108-RpoB(N481H)(命名为B65),XN108-WalK(P221S)/GraS(I136T)(命名为KS65),XN108-WalK(P221S)/GraS(I136T)/RpoB(N481H)(命名为KSB65)。万古霉素耐药性检测结果显示K65和S65的耐药水平降低,而B65的耐药水平与XN108一致。当同时回复WalK(S221P)和GraS(T136I)两个突变则能将XN108回复成VSSA表型。透射电镜观测发现各菌株细胞壁厚度与其万古霉素耐药水平密切相关。自溶实验表明细菌自溶能力恢复程度与细菌耐药能力降低有关。这些结果表明,突变位点回复可将XN108完全重构为VSSA菌株,WalK(S221P)和GraS(T136I)在介导XN108万古霉素耐药性中具有协同作用,而RpoB(H481N)突变对XN108耐药性的贡献较小。3.CcpA-GlmS代谢调控轴在介导VISA形成中的作用与机制多种基因突变可形成VISA,我们推测某种代谢调控分子在介导VISA多种突变基因与共同表型之间发挥重要作用。通过转录组分析,我们发现VISA耐药水平升高伴随着碳源代谢调控分子CcpA表达上调。在XN108中敲除了ccpA,结果XN108ΔccpA万古霉素MIC降为?4μg/ml,回补ccpA后菌株耐药水平得到恢复。进一步在K65及Mu50菌株中敲除ccpA,发现敲除菌万古霉素耐药水平显著降低,说明CcpA在不同VISA菌株背景下均具有调控耐药性的作用。EMSA实验证实WalKR对可直接调控ccpA转录,GraSR对ccpA表达也具有间接调控作用。代谢组学分析了XN108ΔccpA和XN108的39种代谢产物,发现细胞壁合成的前体分子谷氨酰胺在XN108ΔccpA中显著积累,而GlmS关键酶表达降低。EMSA实验表明CcpA可直接调控glmS,形成CcpA-GlmS调控轴。敲除glmS基因使XN108的万古霉素MIC从12μg/ml下降为3μg/ml。上述结果表明VISA多种突变基因可上调CcpA,后者直接调控GlmS,在介导VISA形成中发挥重要作用,为深入理解VISA的形成机理提供了新的理论依据。