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广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis,A.cantonensis）是一种食源性寄生虫,可引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。人作为其非适宜宿主,如若食用了含有广州管圆线虫III期幼虫（L3）的食物或水,幼虫不能在体内发育为成虫而是引起幼虫移行症,多数情况下会移行至到中枢神经系统（CNS）,偶尔会移行至眼部及其他部位。患者可发生嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎,并伴随急性剧烈头痛、颈项强直等症状,严重时可发生昏迷,意识模糊,甚至死亡。由于该病发病急,潜伏期最短只有3天,可见该病能引发很强的炎症反应。但是目前对于广州管圆线虫感染中所引发的炎症通路研究并不是很彻底,虫体蛋白和宿主之间的相互作用也不明确。因此进一步研究其炎症通路,有助于我们探讨该病的致病机制。转凝蛋白（Transgelin protein,TLP）广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内,是稳定细胞骨架和维持细胞生命活动的重要因子。TLP不仅可以和纤维状肌动蛋白（filamentous actin,F-actin）结合促使细胞骨架稳定,介导解构过程维持细胞骨架的动态平衡,而且还参与各种生命活动,并高表达于生命活动较多的器官和组织;此外TLP还可以介导下游炎症通路,促进炎症反应的发生。基于转凝蛋白与炎症通路的密切联系,我们将对Ac-TLP的结构以及功能进行初步的研究。并期望通过本课题,进一步揭示广州管圆线虫的致病机制,为日后防治工作奠定基础。研究目的:从广州管圆线虫IV期幼虫cDNA文库中鉴定编码TLP的基因序列,对其进行克隆表达,获得重组蛋白。同时分析Ac-TLP的抗原性、其在广州管圆线虫感染后不同时期的转录表达。探究Ac-TLP对RAW264.7细胞NF-κB通路的影响,从而进一步探讨Ac-TLP在广州管圆线虫感染中的作用及其分子机制。研究方法:1.Ac-TLP基因的生物信息学分析利用生物信息学分析软件以及结构分析网站,对广州管圆线虫IV期幼虫cDNA文库中的Ac-TLP基因进行结构分析与功能预测等。2.Ac-TLP基因克隆表达和重组质粒的构建设计引物后利用PCR技术扩增Ac-TLP基因,随后将其与表达载体p ET-32a（+）连接,并进行双酶切验证和测序验证。3.重组蛋白rAc-TLP的诱导表达以及纯化将构建成功的p ET-32a（+）-Ac-TLP重组质粒转化入E.coli（BL21）中进行诱导表达。用IPTG进行诱导,并确定最佳诱导条件获得重组蛋白rAc-TLP,随后对该蛋白进行可溶性分析。用Ni-NTA亲和层析法纯化该蛋白,经SDS-PAGE鉴定后,用BCA法测量该蛋白浓度。4.重组蛋白rAc-TLP抗原性分析将广州管圆线虫感染小鼠血清作为阳性对照,将正常小鼠血清作为阴性对照。分别对rAc-TLP和担体蛋白（Trx protein）进行western blotting,以分析rAc-TLP的抗原性。5.实时荧光定量PCR（q RT-PCR）收集感染后不同时期的虫体,提取各期虫体RNA并逆转录cDNA,设计引物通过q RT-PCR检测rAc-TLP在不同感染期的相对表达水平。6.巨噬细胞NF-κB通路情况用不同的干预方法设置三组:巨噬细胞+Elution Buffer（Elution Buffer组）、巨噬细胞+Trx protein（Trx组）和巨噬细胞+rAc-TLP（rAc-TLP组）。以p65为内参,采用western blotting方法检测各组内p-p65的相对表达量,从而检测NF-κB通路情况。7.小鼠脑组织NF-κB通路情况设置未感染组,7D、14D和21D四个组。对各组的小鼠脑组织进行蛋白提取,采用western blotting方法,检测p-p65在脑组织中的表达量,从而检测NF-κB通路情况。研究结果:1.经分析,Ac-TLP基因471 bp,其ORF编码156氨基酸（amino acid,aa）,预测该序列编码蛋白的等电点为7.6,分子量为17.71 k Da,是一个亲水性蛋白。不含有跨膜结构和信号肽,初步推测有可能是胞内蛋白。同时发现该序列含有一个完整的calponin-homology（CH）结构域,且具有多个磷酸化位点,可以被多个通路所调节。2.经PCR成功扩增Ac-TLP,将其与原核表达载体进行连接,经双酶切验证和测序结果显示成功构建p ET-32a（+）-Ac-TLP原核表达重组质粒。3.成功诱导出rAc-TLP,经SDS-PAGE分析重组蛋白为可溶性蛋白,经亲和层析纯化后得到浓度为200 mg/ml的重组蛋白rAc-TLP。4.Western blotting结果显示,rAc-TLP能被和广州管圆线虫感染的小鼠血清识别,而不能被正常小鼠血清所识别。而作为对照的担体蛋白则与两种血清都不反应。5.qRT-PCR结果表明Ac-TLP在虫体感染后各个时期都有表达,检测到在雌虫阶段表达量最高,推测该基因可能与虫体生命活动相关。6.体外实验结果显示rAc-TLP可激活巨噬细胞中的NF-κB通路。rAc-TLP组的p-p65表达量显著高于Trx组和Elution组,而Elution组和Trx组并无统计学差异。7.Western blotting结果显示,7D,14D和21D的p-p65表达量显著高于未感染组。广州管圆线虫感染过程中,存在NF-κB通路被激活的现象。结论:成功构建出广州管圆线虫转凝蛋白的重组表达质粒p ET-32a（+）-Ac-TLP,并获得可溶性重组蛋白rAc-TLP,Western blotting显示该重组蛋白具有良好的抗原性。q RT-PCR检测显示Ac-TLP在不同发育时期的虫体中均有表达,且在雌虫阶段的表达量达到高峰,其高表达可能与广州管圆线虫生命活动有关。体外实验表明rAc-TLP能诱导巨噬细胞激活NF-κB通路,促进炎症反应。同时,广州管圆线虫感染小鼠脑组织,存在NF-κB通路被激活的现象。