【摘 要】
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目的:利用磁性金属有机骨架材料（magnetic metal organic frame materials,MMOFs）固定化酶快速从天然中药黄芩（Scutellaria baicalensis）中筛选出潜在的胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase,PPL）抑制剂,期望得到安全有效的小分子活性成分,为临床肥胖治疗提供更加可靠的先导化合物。建立固定化酶与UPLC-Q-TOF-
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目的:利用磁性金属有机骨架材料（magnetic metal organic frame materials,MMOFs）固定化酶快速从天然中药黄芩（Scutellaria baicalensis）中筛选出潜在的胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase,PPL）抑制剂,期望得到安全有效的小分子活性成分,为临床肥胖治疗提供更加可靠的先导化合物。建立固定化酶与UPLC-Q-TOF-MS/MS技术相结合方法,为快速从天然药物中筛选鉴定出有效的活性成分提供新的思路。方法:1.通过溶剂热法合成了羧基修饰的Fe3O4磁性纳米粒子,然后将Fe3O4与2-氨基对苯二甲酸、Zr Cl4按特定比例通过溶剂热法在高温高压下合成了金属有机骨架（metal organic frame materials,MOFs）包裹的Fe3O4纳米粒子核壳式复合材料（Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2）。以戊二醛为交联剂,将胰脂肪酶固定在Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2纳米粒子表面,制得以磁性纳米材料为内核的固定化胰脂肪酶,即Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2@PPL。采用傅里叶红外光谱仪、X射线衍射仪以及透射电子显微镜对合成的材料进行表征。2.采用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白为标准蛋白,测定了不同条件下固定化酶的载酶量,并采用对硝基苯酚法分别测定了不同条件下合成固定化酶的活性,以此确定固定化酶的最佳合成条件。3.利用固定化酶通过配体垂钓的方法从黄芩中垂钓出潜在的胰脂肪酶抑制剂,通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,对筛选出来的活性成分进行鉴定。4.采用对硝基苯酚法以及分子对接实验对筛选出来的可能的胰脂肪酶抑制剂进行酶抑制活性验证。结果:1.合成的Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2@PPL红外光谱显示,UiO-66-NH2的1651 cm-1处特征峰由于结合脂肪酶的影响发生了偏移,变为1620 cm-1,表明脂肪酶已成功的固定在Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2纳米粒子表面。合成的Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2的X射线衍射谱图显示即含有Fe3O4的特征峰,又包含UiO-66-NH2的特征峰,表明核壳式磁性金属有机骨架复合材料成功合成。同时Fe3O4-COOH@UiO-66-NH2的透射电镜核壳式图像结果再次表明UiO-66-NH2已成功包裹在Fe3O4表面。2.测定了载体与酶不同质量比、交联时间、交联剂浓度等条件下固定化酶的载酶量以及酶活性,结果表明当载体与酶的质量比为2:1,交联时间为2 h,交联剂浓度为150 m M时,固定化酶具有最高酶活性。3.利用固定化酶结合UPLC-Q-TOF-MS/MS技术从黄芩中筛选鉴定出8种可能的胰脂肪酶抑制剂,分别为2ˊ,3,5,6ˊ,7-五羟基黄酮、高黄芩素、黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩黄酮Ⅱ、汉黄芩素和千层纸素A,均为黄酮类化合物。4.从配体垂钓筛选出的化合物中,选取黄芩苷、汉黄芩素和千层纸素A进行体外胰脂肪酶抑制活性验证,结果表明,与阳性药奥利司他相比（1.9±0.6μM）,这三个化合物均具有胰脂肪酶抑制活性,其IC50值分别为黄芩苷（242.2±5.6μM）、汉黄芩素（168.5±8.4μM）、千层纸素A（82.7±3.6μM）。此外,对配体垂钓筛选出来的8个化合物进行分子对接研究,结果表明,这8个化合物均可以和胰脂肪酶结合。结论:本论文利用磁性金属有机骨架材料固定化酶通过配体垂钓的方法从中药黄芩中筛选鉴定出8种胰脂肪酶抑制剂,为中药治疗肥胖的研究提供了依据。本研究建立了磁性纳米金属有机骨架材料结合UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的方法,相比传统活性成分分离方法,该方法能简便、快速、高效地从中药中筛选鉴定出其潜在的小分子活性成分。此外,该方法巧妙的结合了磁性纳米粒子和金属有机骨架的优势,提高了固定化酶的蛋白负载量及稳定性,操作便捷,为从天然产物中寻找酶抑制剂提供了新方向,具有一定的应用价值。
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