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甲基营养菌被定义为“能够利用包含一个或多个碳原子但不含碳碳键的低碳复合物生长的一类微生物”,它的代谢途径特殊且应用广泛,因此研究该类菌的代谢与调节机制无论从理论上还是实际应用上都具有重要的意义。实验所用的菌株甲基营养菌MB200,能够利用甲醇作为唯一能源和碳源生长且合成L-丝氨酸,但其对L-丝氨酸的耐受浓度较低,为15 mg/mL本工作拟筛选和研究与L-丝氨酸耐受性相关基因,为后续的代谢与调节机制研究提供基础。实验室的前期工作中,已利用质粒转座子pTnMod-RKm’成功构建了甲基营养菌MB200的突变体库,本实验通过向培养基中添加L-丝氨酸的方法,以20 mg/mL作为初始筛选浓度从突变体库中共筛选到177株耐受L-丝氨酸的突变体。分别提取突变体的基因组DNA,用限制性内切酶BamHI随机酶切后连接到载体pMD18-T上,导入大肠杆菌感受态细胞DH5α中,利用双抗性(转座子与T载体的抗性)在转化平板上挑取转化子,提取质粒并酶切验证后进一步测序,共从这177株突变体中成功克隆到了1 8个基因。分别对这18个基因进行了生物信息学分析,发现从突变体S046中克隆到的基因serA与Methylobacterium extorquens DM4的serA基因在核苷酸水平上有91%的一致性,与Methylobacterium extorquensAM1的serA在氨基酸水平上有94%的相似性。该基因全长1,251 bp,其编码的3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)催化磷酸化合成L-丝氨酸的第一步反应,且在该酶C末端存在有ACT功能域其上有L-丝氨酸结合位点。实验进一步发现在甲基营养菌MB200中存在有PGDH酶活性,且该酶的酶活受L-丝氨酸的调控,当添加L-丝氨酸使其终浓度为40μM时PGDH酶活性降低了约44%,当继续增加体系中L-丝氨酸的浓度发现酶活变化不大。后又通过表达载体pCM80分别构建了serA基因及缺失了PGDH酶C末端ACT功能域后的serA△77基因过量表达的两个重组体MB200/pCM80serA和MB200/pCM80serA△77,酶活检测发现前者酶活受L-丝氨酸浓度影响较大,当L-丝氨酸浓度达到40μM时,其PGDH酶活降低了约33%；后者的PGDH酶活基本不变且对L-丝氨酸浓度变化不敏感。本工作还通过静息细胞反应体系的制备对这两个重组菌及原始菌株进行了发酵产L-丝氨酸的分析,结果发现MB200/ pCM80serA和MB200/pCM80serA△77的产量分别为13.6 mg/mL及16.8 mg/mL,较之原始菌株M.sp MB200的6.4 mg/mL有所提高,且MB200/pCM80ser△77的产量约是M.sp MB200的2.6倍。