论文部分内容阅读
虾青素(Astaxanthin),是类胡萝卜素中的最高级产物,具有强抗氧化性,结构分为左旋、右旋、内消旋三种,其中左旋结构抗氧化性最强。除了抗氧化性之外,虾青素还具有许多其它功能,如作为维生素A的前体、清除体内自由基、抗癌等。已知的天然虾青素来源中只有藻源(雨生红球藻)虾青素的结构为100%左旋,但其不利于大规模生产。随着分子生物学的发展,利用蓝藻基因工程来大量生产虾青素将会是未来的发展趋势。本实验主要选择了一种模式藻一集胞藻PCC6803来生产虾青素,目前还未发现利用集胞藻PCC6803来生产虾青素的相关报告。在本文中,我们对雨生红球藻712和集胞藻PCC6803进行纯化,获得了纯的藻株；设计特异性引物进行PCR扩增,成功克隆出集胞藻PCC6803中高效启动子psbA2及同源臂psbA2 downstream和雨生红球藻中合成虾青素途径中的两个关键基因Bkt、CRTR-B基因,通过生物学软件对其基因序列的理化性质和蛋白二级结构、三级结构进行分析,结果显示Bkt基因编码320个氨基酸,蛋白分子量为36009.7 D,分泌途径为“-”型,即定位到其他细胞器,而CRTR-B基因编码293个氨基酸,蛋白分子量大小为31958.2 D,分泌途径为“M”型,即定位到线粒体中；两者均具有跨膜螺旋区,无信号肽,主要由α-螺旋(αα-helix)、β-折叠(β-strand)和coil组成,为疏水蛋白。分别构建了5sT1T2-Bkt+Kana表达载体和5sT1T2-CRTR-B+Kana表达载体,并通过天然转化方法分别转入集胞藻PCC6803中,利用抗生素筛选和PCR筛选分别得到转入Bkt基因和CRTR-B基因的集胞藻PCC6803转化子数株,从中选出4株Bkt转化子和3株CRTR-B转化子进行后续分析。荧光定量PCR结果表明在转录水平上转入Bkt基因的集胞藻PCC6803转化子低于转入CRTR-B基因的集胞藻PCC6803转化子,但两者均有表达；western blot检测表明四株转入Bkt基因的集胞藻PCC6803转化子在翻译水平上均有表达,而三株转入CRTR-B基因的集胞藻PCC6803转化子中只有CRTR-B转化子1在翻译水平上有表达,CRTR-B转化子2和3未表达；利用高效液相色谱法分析分别转入B幻基因和CRTR-B基因的集胞藻PCC6803转化子,结果表明在四株Bkt转化子和CRTR-B转化子1中检测到了虾青素的存在,成功获得了产虾青素的集胞藻藻株,其中转入Bkt基因的集胞藻PCC6803转化子中虾青素含量达89.57/.μg/g,转入CRTR-B基因的集胞藻PCC6803转化子中虾青素含量达59.28 gg/g。选择虾青素含量相对较高的Bkt转化子2、Bkt转化子3、CRTR-B转化子1和野生型集胞藻PCC6803相同条件下培养相同时间,测其在波长为730 nm时得OD值,绘制生长曲线,结果表明外源基因的转入并未对集胞藻PCC6803的生长造成损害。本实验获得的转基因集胞藻PCC6803藻株通过优化培养可作为虾青素生产的实验材料,为后期研究和生产提供一定的理论依据。