【摘 要】
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水稻是我国最重要的粮食作物之一,在农业生产中占有十分重要的地位。CRISPR/Cas9基因编辑技术能实现对目的基因的精准编辑,具有操作简单、周期短、效率高等优点。在水稻研究中,基于组织培养的农杆菌介导法是CRISPR/Cas9系统转化最常用方法,但转化周期长,易产生嵌合体,并且部分品种组织培养难度较大,严重影响了水稻遗传转化进程。从基因工程改造和分子育种的角度,理想手段是对生殖细胞进行遗传转化。花
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0102102\2017YFD0100104）； 广东省重点领域研发计划（2018B02020600）； 国家水稻产业技术体系建设专项（CARS-01-17）；
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水稻是我国最重要的粮食作物之一,在农业生产中占有十分重要的地位。CRISPR/Cas9基因编辑技术能实现对目的基因的精准编辑,具有操作简单、周期短、效率高等优点。在水稻研究中,基于组织培养的农杆菌介导法是CRISPR/Cas9系统转化最常用方法,但转化周期长,易产生嵌合体,并且部分品种组织培养难度较大,严重影响了水稻遗传转化进程。从基因工程改造和分子育种的角度,理想手段是对生殖细胞进行遗传转化。花粉因其资源丰富、易处理等优点,是将外源基因引入生殖细胞系的理想靶标。水稻花粉表面具有萌发孔,外源物质可通过萌发孔被吸收进入花粉。但是,由于CRISPR/Cas9系统分子量较大,稳定性较差,且容易被很快降解或结合。因此,需要开发既能避免组织培养过程,又能安全高效递送CRISPR/Cas9系统至水稻生殖细胞的转化新技术。随着纳米生物技术的发展,纳米材料（MNP）安全、低毒、细胞相容性好,为直接转化水稻生殖细胞提供了有利条件。本研究以MNP和水稻品种日本晴作为实验材料,对以下四个方面进行了研究:MNP与CRISPR/Cas9质粒的结合效率、MNP-CRISPR/Cas9复合物磁转染水稻花粉的过程、CRISPR/Cas9质粒磁转染后代的编辑效率以及后代遗传稳定性分析,探索磁性纳米载体基因转导体系在水稻育种遗传转化上的可行性。研究结果表明:（1）以MNP作为基因载体,负载CRISPR/Cas9质粒制备不同质量比的复合物。分析了MNP负载、保护CRISPR/Cas9质粒的能力,并对其粒度分布、Zeta电位、结合形态进行研究。结果表明,MNP通过静电作用压缩、吸附、聚集CRISPR/Cas9质粒,形成纳米载体-基因复合物,MNP能有效装载相当于自身质量16倍的CRISPR/Cas9质粒,并保护负载的CRISPR/Cas9质粒免受酶促降解。（2）不同质量比复合物磁转染对花粉萌发率影响,接着为了分析磁转染能否将复合物传送至花粉内部,研究了磁转染后复合物在花粉中的定位。结果表明,授粉花粉密度为2朵花/30 ul时能满足实验要求;不同质量比复合物磁转的花粉能够正常萌发,当复合物质量比为1:4、1:8、1:16时对花粉萌发有促进作用,复合物质量比为1:1时有抑制作用;与对照相比,磁转染的花粉内部有很多白色亮点,能谱分析检测到花粉中含有Fe元素,证明了复合物能通过萌发孔到达花粉内部。（3）构建了靶向水稻fgr基因的CRISPR/Cas9质粒,利用MNP负载CRISPR/Cas9质粒对日本晴成熟花粉进行了磁转染,然后进行人工授粉并收获种子种植T1代。调查了T1代植株的农艺性状,并筛选T1代转基因植株,然后对转基因植株进行靶点测序及突变个体表型分析。结果表明,磁转染后的T1代植株,其株高降低,结实率较低,其他方面无明显变化。通过潮霉素和Cas9基因检测,在176株T1代植株中检测出23株阳性单株,转化率约为13.07%。测序分析显示仅有2株在靶点位置发生了突变,分别为双等位突变和杂合突变。与对照相比,突变植株植株较矮小、剑叶长较短、结实率较低,其它方面无明显变化。（4）将T1代转基因植株按照株系种植,通过筛选T2代阳性植株以及靶点测序分析,对磁转染后代遗传稳定性进行研究。结果表明,在T2代中共检测出155株阳性植株,潮霉素基因分离基本符合孟德尔遗传规律,说明通过磁转染法转的外源基因能遗传给后代。在T1代发生突变的两个株系,其T2代均发生了分离;部分在T1代未发生突变的株系,在T2代产生了突变,包括2个纯合突变和7个双等位突变,说明Cas9基因在T2代可以继续进行基因编辑,不过编辑效率较低。本研究表明。MNP可作为一种基因载体,有效负载、保护CRISPR/Cas9质粒。能通过磁转染法将MNP-CRISPR/Cas9复合物传递至水稻花粉内部,授粉结实后产生目标基因编辑植株;部分Cas9阳性T1代植株靶基因未发生编辑,但可通过自交继续发挥编辑作用。与依赖组织培养的遗传转化方法相比,本研究方法操作简便、耗时较短,证明了磁性纳米载体基因转导体系在水稻育种遗传转化上的可行性,为水稻优良品种培育提供了新方法。
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