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目的:缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）是仅次于缺血性心脏病的第二大死因。目前,静脉溶栓疗法是目前唯一批准的临床证实有效的治疗方法,但是该方法具有时间窗局限性而且存在引起严重脑缺血的潜在风险。缺血后继发性脑损伤的机制可能是由于缺血后脑内炎症的产生,炎症反应加快了缺血性损伤的形成并影响神经元死亡和组织再生。神经炎症的特征是小胶质细胞的激活和促炎细胞因子分泌的增加。越来越多研究证明,调控小胶质细胞极化抑制小胶质细胞激活从而保护神经元可能是治疗缺血性脑损伤的重要方法。痘苗病毒致炎兔皮提取物（Analgecine,AGC）是从牛痘病毒致炎的日本大耳白兔的兔皮组织中提取的一种生物活性制剂。前期研究表明,AGC能缩小大鼠中动脉栓塞中缺血大鼠脑梗死面积,提高大鼠行为学评分,但其作用机制不明确。本研究的目的是基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨AGC调控小胶质细胞极化抑制炎症反应的作用机制。方法:（1）建立缺糖缺氧/复糖复氧损伤小胶质细胞模型:将小鼠小胶质细胞（BV-2）加入含连二亚硫酸钠（Na2S2O4）无糖培养基进行氧糖剥夺1.5 h后换为正常培养基,同时给予不同浓度AGC（0.25,0.5,1U/mL）,共同孵育3 h后进行细胞处理。（1）取细胞上清液测定细胞因子的含量,观察AGC对细胞因子分泌的影响。（2）应用流式细胞术观察M1型小胶质细胞表型标记物CD16+CD32+表达。（3）应用western blot法检测TLR4、TLR9、MyD88、TRAF6、p-p65、p65的表达。（4）应用激光共聚焦显微镜观察p65核转位情况。（2）将MyD88-siRNA转染至BV-2细胞中,培养43.5 h后更换培养基,加入含连二亚硫酸钠（Na2S2O4）无糖培养基进行氧糖剥夺1.5 h后换为正常培养基,同时给予不同浓度AGC,共同孵育3 h后进行细胞处理。应用western blot法检测TLR4、MyD88、p-p65、p65的表达。（3）采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和干扰素（interferon,IFN）-γ刺激BV-2细胞18 h将其诱导成M1型后换为正常培养基,同时给予不同浓度AGC,共同孵育24 h后进行细胞处理。采用流式细胞术观察M1型小胶质细胞表型标记物CD16+CD32+和M2型小胶质细胞表型标记物CD206+表达。（4）采用白介素-4（interleukin-4,IL-4）刺激BV-2细胞24 h将其诱导成M2型,加入LPS+IFN-γ刺激18 h将其从M2向M1型极化后换为正常培养基,同时给予不同浓度AGC,共同孵育24 h后进行细胞处理。采用流式细胞术观察M1型小胶质细胞表型标记物CD16+CD32+和M2型小胶质细胞表型标记物CD206+的表达。（5）用LPS+IFN-γ刺激BV-2细胞18 h将其诱导成M1型后换为正常培养基,同时给予AGC孵育24 h后,更换培养基,之后采用Transwell培养方法,将BV-2细胞与C57小鼠原代皮层神经元非接触共培养24 h,加入MAP-2抗体进行染色,采用免疫荧光法观察神经元形态变化。（6）用LPS+IFN-γ刺激BV-2细胞18 h将其诱导成M1型后换为正常培养基,同时给予AGC孵育24 h。更换培养基,使用接触共培养方法,将BV-2细胞与C57小鼠原代皮层神经元直接接触共培养24 h,加入MAP-2抗体进行染色,采用免疫荧光法观察神经元形态变化。结果:（1）采用Luminex法检测氧糖剥夺再恢复（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）后细胞培养上清液中细胞因子的分泌。结果发现,与对照组相比,OGD/R组细胞上清液中Eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12P40、IL-12P70、IL-17α、MIP-1β、TNF-α分泌增多,IL-4、IL-10分泌减少;与OGD/R组相比,AGC各剂量组及肽1、肽5组能减少细胞上清液中Eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12P40、IL-12P70、IL-17α、MIP-1β、TNF-α的分泌,同时增加IL-4、IL-10的分泌。（2）采用流式细胞术观察OGD/R后小胶质细胞M1型表型标记物的表达。结果发现,与对照组相比,OGD/R组M1型表型标记物CD16+CD32+表达增多;与OGD/R组相比,AGC各剂量组M1型表型标记物CD16+CD32+表达减少。（3）采用western blot法观察TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果发现,与对照组相比,OGD/R组TLR4、MyD88、TRAF6及NF-κB p-p65蛋白表达增多;TLR9无明显变化;western blot和免疫荧光结果显示,小胶质细胞核蛋白中p65的表达增多,胞浆蛋白中p65的表达减少,p65出现核转位。与OGD/R组相比,AGC各剂量组TLR4、MyD88、TRAF6、p-p65蛋白表达减少,核蛋白中p65的表达减少,胞浆蛋白中p65的表达增多,p65核转位情况被抑制。（4）为了明确AGC是否通过调节MyD88依赖通路而调控小胶质细胞极化,采用小干扰RNA（siRNA）技术,将MyD88-siRNA转染入BV-2细胞。结果发现,与对照组相比,MyD88-siRNA组MyD88表达降低;与MyD88-siRNA相比,经过OGD/R处理后,MyD88、p-p65/p65表达略有增加;与MyD88-siRNA+OGD/R组相比,AGC给药后,高剂量AGC组明显降低MyD88的表达,对p-p65/p65表达无影响,并且AGC对TLR4表达无影响。结果表明AGC可能通过MyD88依赖通路和MyD88非依赖通路共同调控小胶质细胞极化。（5）采用流式细胞术观察AGC定向调控小胶质细胞的作用。结果发现,与对照组相比,LPS+IFN-γ组CD16+CD32+表达增多,CD206+表达减少;与LPS+IFN-γ组相比,AGC各剂量组CD16+CD32+表达减少,CD206+表达增多。与IL-4组相比,IL-4+LPS+IFN-γ组CD16+CD32+表达有增多趋势,CD206+表达有减少趋势;与IL-4+LPS+IFN-γ组相比,AGC各剂量组CD16+CD32+有减少趋势,CD206+表达有增多趋势。（6）采用Transwell和接触共培养法将神经元与LPS+IFN-γ损伤的小胶质细胞共培养,采用免疫荧光法观察神经元形态。结果发现,正常培养状态下的神经元突起完整且连续;与正常的BV-2细胞共培养后,神经元形态无明显变化;与LPS+IFN-γ损伤的小胶质细胞共培养后,神经元突起变短且不连续;而与经AGC给药处理后的M1型小胶质细胞共培养后,神经元突起结构相对未给药组完整、连续。结论:AGC调控小胶质细胞从M1型向M2型极化,抑制炎性细胞因子的分泌,增加抑炎细胞因子的分泌,保护神经元;AGC调控小胶质细胞极化的机制可能与AGC抑制TLR4/MyD88/p65信号通路的激活有关。