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背景:全球十大公害之首已被认为是噪声污染,由于噪声引起的听觉受损是制造业、农业、航海等最常见的可导致损伤的因子。另外,随着发展中国家的经济进步,建设噪声、交通噪声日益明显,影响着人们的健康。噪声性聋是感应神经性聋,是工业、交通、建筑中不可避免的损伤,国内外医学专家非常重视对噪声性听力受损的基础研究,并且研究中一致认为噪声听力损伤发病机制可以大致分为2类:第一类为组织机械应力性损伤:噪声震波引起内耳系统模型组织的剪切应力损伤,淋巴液外流,并可使内耳正常毛细胞和正常支持细胞结构的破坏,静纤毛结构在同一时间内耳毛细胞内出现异常;长期高频噪声的代谢性创伤:长期噪声环境下不光使心血管系统发生障碍,更使听觉代谢的环境发生物质循环障碍,毛细胞传递信号需要的能量上升。消耗氧及消耗糖在毛细胞和支持细胞的静息也增加,局部组织出现相对缺氧,三价阳离子负荷增加及二价钙离子在细胞内上升,引起静纤毛核苷酸合成错误,氨基酸合成异常,毛细胞在耳蜗缺氧环境下面临着的破坏和程序性的调亡。但噪声性听觉损伤二十世纪就针对性的治疗研究不多,仍处于探索阶段,治疗效果不肯定,这是各国军事医学所面临的难题。国内有少量文献资料报道,利用左慈丸等滋阴的中成药方法治疗噪声性听力损害,其疗效评价也不一,无法使绝大多数重度耳聋恢复。仿生学的治疗是二十一世纪对噪声性听力创伤的治疗的主要方法。通过采取助听器放大和人工耳蜗改善传递,因此其效果直接接受到螺旋神经元数目的影响。人造耳蜗的产生和应用是听力损伤医疗的一个重要突破,目前对于治疗重度和极重度双耳听力损伤最常用、效果最确切的方法。但是,由于其不能影响感觉上皮对各个频段音频刺激进行精准处理,因此使用了人造耳蜗的病人仍然不可能完全清晰的分辨各个频段音频刺激。于是,人们关注听觉毛细胞的分化再生,这将有可能为噪声性耳聋提出新的思路,并且弥补人工耳蜗使用的局限。近年来,基因工程技术的迅速发展为噪声性听力损伤的治疗的治疗提供了新的理论基础和手段。
目的:各种环境下的噪声所导致感音神经性耳聋严重影响人们的生活、工作和学习,是人们急需解决的问题之一。通过将调控毛细胞分化的基因Math-1基因和促进毛细胞生长的基因NGF-b基因共转染动物内耳的系列研究,观察Math-1/NGF-b基因共转染是否对噪声性听力损伤具有保护作用,两者是否具有协同增强恢复听力作用,为噪声性听力损伤提供新理论和物质基础。
方法:本实验采用听力正常(ABR筛选听力阈值20dB)成年豚鼠35只,体重在250-300g之间。在稳态噪音混音条件下(稳态噪音混音室内,四周和中点噪音强度相差度≤10dBA,噪音频段性质达到中心频率为3000 Hz的窄带F噪音,宽度控制于1000 Hz。噪声110dB,每次8小时,连续3天,每次即时测定ABR。每2小时以声级计测试保证声源和功放工作稳定),制造耳聋豚鼠模型,用ABR检测筛选出耳聋达标豚鼠(阈移达到60dB)。将噪声模型动物分为4组分别为空病毒对照组(5只),Math-1/NGF-b组(10只),Math-1组(10只)和NGF-b组(10只),将各组豚鼠分别转染带有Math-1/NGF-b,Math-1和NGF-b的腺病毒,对照组转染空病毒。构建携带Math-1/NGF-b,Math-1和NGF-b三种序列的5环腺病毒过表达载体,并且根据腺病毒的滴度公式: T=101+d(s-0.5)/0.1ml(其中,d=Log10稀释度,如为10倍稀释梯度则d=1,S=各浓度细胞病变比率之和),使病毒滴度达到1012/ml。对豚鼠右耳通过圆窗膜进行转染,实验组分别转染Math-1/NGF-b,Math-1和NGF-b,对照组转染空病毒。给予同一只豚鼠左耳行同样的操作但不转染。最后分别在第3,7,14日分别进行ABR测试,观察耳聋豚鼠听力恢复情况,取右侧耳蜗膜性组织进行扫描电镜观察内耳毛细胞形态(基因转染组每组5只),RT-PCR检验与免疫组化观察基因转染情况(基因转染组每组5只),以及毛细胞形态学表现及不同治疗组之间的差别。
结果:1.噪声性耳聋豚鼠模型构建成功,在噪声暴露首个8小时,经过不连续噪声暴露总计时间达到24小时的豚鼠,其听力阈移高达60dB,并且跟踪3日ABR检测听力不能恢复。扫描式电子显微镜检查下,各段毛细胞明显出现缺失,并且以第三、第四回最为明显,第一、第二回次之。
2.腺病毒载体构建及动物内耳转染成功:构建了携带Math-1/NGF-b,Math-1,NGF-b的腺病毒过表达载体,备制腺病毒滴度均以达到1012/ml。成功对噪声性耳聋豚鼠的右耳进行完整圆窗膜下过表达腺病毒载体转染转染,转染后对豚鼠听力损害小(5±1.6dB)。
3.转染后3日。ABR测试:Math-1/NGF-b组及其Math-1组豚鼠ABR提示听力已有恢复,且Math-1/NGF-b组恢复较好(Math-1/NGF-b组约5±1.8dB,Math-1组5±0.9dB),差异相比转染前有显著性(P=0.03＜0.05)。但是NGF-b组及空病毒对照组ABR未见有明显听力恢复。扫描式电子显微镜:Math-1/NGF-b组及其Math-1组豚鼠耳蜗毛细胞损坏量比转染前有所减轻(Math-1/NGF-b组约6±0.7个,Math-1组5±1.3个),差异相比转染前有显著性(P=0.02＜0.05),并且观测到的毛细胞上纤毛的排列仅呈现为阶梯状,未显示倒三角形排列,为新生毛细胞。免疫组织化学:Math-1/NGF-b组、Math-1组、NGF-b组均可见转染后表达的增强绿色荧光,在毛细胞及其周围的基底细胞处表达明显,但是仅有Math-1/NGF-b组、Math-1组出现少量MyoVIIa阳性的新生毛细胞,NGF-b组及其空病毒对照组未见MyoVIIa阳性细胞。
4.转染后7日。ABR测试:Math-1/NGF-b组、Math-1组及其NGF-b组豚鼠ABR提示听力均有所恢复,但是Math-1/NGF-b组、Math-1组明显好于NGF-b组(Math-1/NGF-b组约8±3.1dB,Math-1组7±2.9dB,NGF-b组4±1.3dB),差异相比转染前有显著性(P=0.02＜0.05)。但是空病毒对照组ABR仍然未见有明显听力恢复。扫描式电子显微镜: Math-1/NGF-b组、Math-1组和NGF-b组豚鼠耳蜗毛细胞损坏量比转染前有所减轻,Math-1/NGF-b组最好,Math-1组次之(Math-1/NGF-b组8±0.4个,Math-1组6±1.1个,NGF-b组3±1.2),差异相比转染前有显著性(P=0.03＜0.05),并且观测到的毛细胞上纤毛的排列仅呈现为阶梯状,未显示倒三角形排列,为新生毛细胞。免疫组织化学: Math-1/NGF-b组、Math-1组、NGF-b组均有转染后表达的增强绿色荧光,在毛细胞及其周围的基底细胞处表达明显。Math-1/NGF-b组、Math-1组出现的MyoVIIa阳性的新生毛细胞明显增多,并且以Math-1/NGF-b组居多(×200镜下,Math-1/NGF-b组17±3.2个,Math-1组12±1.7个),而NGF-b组也出现少许MyoVIIa阳性的新生毛细胞,空病毒对照组未见MyoVIIa阳性细胞,各组间差异有显著性(P＞0.05)。
5.转染后14日。ABR测试:Math-1/NGF-b组、Math-1组及其NGF-b组豚鼠ABR提示听力有所恢复,是Math-1/NGF-b组、Math-1组明显好于NGF-b组(Math-1/NGF-b组约13±2.2dB,Math-1组9±1.3dB,NGF-b组6±2.2dB),差异相比转染前有显著性(P=0.02＜0.05)。空病毒对照组ABR仍然未见有明显听力恢复。扫描式电子显微镜:Math-1/NGF-b组、Math-1组、NGF-b组豚鼠耳蜗毛细胞损坏量比转染前有所减轻,Math-1/NGF-b组最好,Math-1组次之(Math-1/NGF-b组约12个,Math-1组8个,NGF-b组4个),且差异相比转染前有显著性(P=0.02＜0.05)并且观测到的毛细胞上纤毛的排列仅呈现为阶梯状,未显示倒三角形排列,为新生毛细胞。空病毒对照组扫描电镜未见有明显毛细胞损伤减轻及新生毛细胞。免疫组织化学:Math-1/NGF-b组、Math-1组、NGF-b组均有转染后表达的增强绿色荧光,在毛细胞及其周围的基底细胞处表达明显。Math-1/NGF-b组、Math-1组出现的MyoVIIa阳性的新生毛细胞增多,并且以Math-1/NGF-b组居多(×200镜下,Math-1/NGF-b组17±3.2个,Math-1组12±1.7个),而NGF-b组也出现MyoVIIa阳性的新生毛细胞也有增加但与7日相比无显著性,空病毒对照组未见MyoVIIa阳性细胞。
结论:1.非连续噪声暴露24小时豚鼠听力阈移达60dB,跟踪3日ABR检测听力不能恢复。2.成功构建了携带Math-1/NGF-b,Math-1,NGF-b的5环腺病毒。3.Math-1/NGF-b组,Math-1组、NGF-b组转染后都可见豚鼠听力恢复,但是Math-1/NGF-b组,Math-1组恢复时间早,效果好,并且Math-1/NGF-b组比Math-1组恢复更明显。4.总之,Math-1/NGF-b转染对于豚鼠噪声性听力损害的保护作用明显优于单基因转染。