论文部分内容阅读
研究目的:胆汁淤积是以胆汁酸分泌或排泄异常为特征的常见病症。持续胆汁淤积加重肝脏损伤,可发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌及胆管癌。以胆汁淤积为主要表现的肝脏疾病统称为胆汁淤积性肝病,然而目前临床用于治疗胆汁淤积性肝病的药物存在不足。黄芪汤始载于《太平惠民合剂局方》的经典方,具有“补气益虚损之功”,广泛用于肝纤维化、肝硬化等慢性肝病的治疗。我们前期研究证实黄芪汤具有抗急性肝内胆汁淤积作用,但黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积的影响以及可能的作用机制尚不清楚。因此,本研究采用1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydroxychollidine,DDC)诱导的慢性肝内胆汁淤积(chronic intrahepatic cholestasis,CIHC)小鼠模型,运用非靶向/靶向代谢组学、16Sr DNA测序以及分子生物学方法,研究黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积性肝损伤的作用及潜在作用机制。通过本研究可为黄芪汤的临床应用及新药开发提供理论依据,同时也为慢性胆汁淤积性肝病的防治提供新思路。研究方法:1.观察DDC诱导剂量、周期对小鼠血生化、肝脏形态学等影响,优化CIHC小鼠模型。2.采用0.025%DDC的饲料诱导CIHC小鼠模型,观察黄芪汤低剂量(2g/kg)、高剂量(4 g/kg)连续给药4周、8周对小鼠血清生化指标、肝组织形态学以及肝纤维化指标的影响,评价黄芪汤对慢性肝内胆汁淤积性肝损伤的保护作用。3.采用基于超高效液相结合二维线性离子阱静电轨道阱组合式高分辨质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap)的非靶向代谢组学的方法,研究黄芪汤给药4周及8周对慢性肝内胆汁淤积小鼠肝脏代谢轮廓的影响,筛选和鉴定差异性代谢物,分析影响的代谢通路;采用基于UPLC-MS/MS的胆汁酸靶向代谢组学方法,研究黄芪汤给药4周和8周后对CIHC小鼠血清和肝脏胆汁酸谱的影响,分析黄芪汤对CIHC小鼠胆汁酸稳态的影响。4.采用Real-time PCR和Western blot方法,检测黄芪汤给药4周和8周对CIHC小鼠胆汁酸转运体、代谢酶、核受体、膜受体、核转录因子及相关炎症因子表达的影响。采用Western Blot方法研究黄芪汤对小鼠炎症、纤维化和胆管增生通路的影响,探索黄芪汤抗慢性胆汁淤积肝损伤的效应机制。5.采用16 Sr DNA测序方法,研究慢性胆汁淤积状态下小鼠肠道菌群的变化及黄芪汤连续干预8周后对肠道菌群的影响,筛选黄芪汤影响的差异菌群,将差异菌属与药效学指标以及血清胆汁酸水平进行相关性分析,探索黄芪汤影响的与胆汁淤积相关的候选肠道菌。结果:1.0.025%DDC饲料诱导CIHC的小鼠血清ALT、AST和TBA水平升高,死亡率低,优化了CIHC小鼠模型。2.黄芪汤给药4周可降低CIHC小鼠ALT、AST、TBA水平;黄芪汤给药8周可降低CIHC小鼠血清ALT的水平。HE染色显示黄芪汤给药4周和8周可明显改善CIHC小鼠胆管细胞增生、汇管区炎症细胞浸润、肝细胞变性坏死等肝组织损伤。天狼星红染色显示黄芪汤可降低胶原沉积,黄芪汤给药8周还降低α-SMA和Collagen I的表达及羟脯胺酸水平。结果表明黄芪汤具有抗DDC诱导的慢性胆汁淤积肝损伤作用,可抑制慢性胆汁淤积所致的肝纤维化水平。3.肝脏非靶向代谢组学结果显示,在正常、模型和黄芪汤给药组之间共鉴定出25种差异代谢物,其中4周可影响13种代谢物含量,黄芪汤给药8周可影响12种代谢物,通过KEGG分析发现,这些差异代谢物主要与初级胆汁酸生物合成等通路有关;胆汁酸靶向代谢组学结果显示,黄芪汤汤给药4周或8周后可降低CIHC小鼠血清和肝脏多种胆汁酸水平,改善CIHC小鼠胆汁淤积。5.黄芪汤给药4周可诱导胆汁酸外排转运体Mrp2、Mrp3、Mrp4、Ost-α的表达,给药8周可继续诱导Mrp4的表达,抑制胆汁酸摄取转运体Ntcp的表达,并能够诱导胆汁酸代谢酶Cyp2b10的表达。黄芪汤给药4周和8周均能够显著诱导核转录因子-E2-因子(Nrf2)的表达。结果表明黄芪汤可促进肝脏胆汁酸外排、抑制胆汁酸摄取、促进胆汁酸代谢,逆转胆汁酸稳态紊乱,而这些作用可能与其诱导Nrf2有关。6.黄芪汤给药8周能够明显降低CIHC小鼠肝脏炎症因子(IL-1β、TNF-α)、细胞粘附因子(ICAM-1)、趋化因子(MIP-2、MCP-1)和生长因子TGF-β的表达,抑制NF-κB炎症通路;还可明显减轻胆管细胞特异性标志物人细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CK-19)的表达以及肝组织Collagen I的表达,黄芪汤抑制胆管增生可能与其抑制NF-κB/IL-6/STAT3通路有关。7.经16 Sr DNA高通量测序发现,CIHC小鼠肠道菌群多样性明显下降、菌群丰富度明显降低,黄芪汤干预8周改善了CIHC小鼠菌群多样性及丰富度;经逐级筛选发现,在OTU分类学水平中黄芪汤可影响17个差异菌种,其中Prevotellaceae＿NK3B31＿group(OTU433)、Alistipes(OTU435)、Parabacteroides(OTU430)、Gordonibacter(OTU383)和Parabacteroides＿goldsteinii(OTU255)与CIHC小鼠药效学指标呈正相关关系,黄芪汤能够明显的降低CIHC小鼠肠道炎症基因的表达,抑制肠道炎症反应。结论:1、黄芪汤具有抑制DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积肝损伤和减轻小鼠肝纤维化作用。2、黄芪汤对DDC诱导的CIHC小鼠可促进胆汁酸外排转运体和代谢酶的表达,抑制胆汁酸摄取转运体表达,促进肝脏胆汁酸的外排及抑制胆汁的摄取,促进胆汁酸代谢逆转胆汁酸稳态紊乱,作用可能与诱导Nrf2表达有关。3、黄芪汤可抑制抑制NF-κB炎性通路,减轻CIHC小鼠肝脏炎症反应,减轻肝细胞损伤;黄芪汤还可抑制IL-6/STAT3通路,抑制CIHC小鼠胆管增生和纤维化。4、黄芪汤可增加CIHC小鼠肠道菌群多样性及丰富度,调节肠道菌群组成,改善胆汁淤积小鼠肠道菌群紊乱,抑制肠道炎症反应,发挥抗胆汁淤积肝损伤作用。