感音神经性聋是临床常见病和多发病,严重影响患者的生活质量,临床上尚无理想的治疗方法。目前关于感音神经性聋的防治研究已成为听力学和耳科学研究的热点和难点之一。近年来,运用胚胎或神经干细胞(neural stem cells,NSCs)以及(neural progenitor cells,NPCs)的替代治疗应运而生,并受到密切的关注。目前大量的研究致力于干细胞/前体细胞移植促进听觉功能恢复,研究方向主要集中于外源性NSCs的直接或定向诱导后移植,或者将NSCs作为外源性基因的载体进行移植。虽然国内外学者在此方面已经进行了很多工作,取得了一定的进展,但仍有很多难题亟待解决。其关键问题之一是:对于NSCs/NPCs在听功能的形成与发育过程中的作用,尤其是听觉中枢神经核团内是否存在多向分化潜能的NSCs/NPCs还不甚清楚。实验一:新生大鼠脑干耳蜗核神经前体细胞的分离、培养目的:目前听觉系统是否存在NSCs/NPCs的研究主要集中在内耳感受神经元的干细胞/前体细胞上,近年研究证实哺乳动物内耳中存在着一定数量毛细胞的前体细胞,而听觉中枢神经核团内是否存在多向分化潜能的NSCs/NPCs目前尚未见报道。本研究拟分离、培养新生大鼠脑干耳蜗核NPCs,观察其增殖及传代特性,建立新生大鼠脑干耳蜗核NPCs的培养方法,为进一步研究打下基础。方法:P1、P3、P5、P7、P9、P11以及成年SD成年大鼠麻醉后,75%酒精消毒,无菌条件下开颅切取脑干耳蜗核,经剪碎、消化、离心、洗涤、吹打、过滤、计数,接种于无血清培养液DMEM/F12 (1∶1)培养,内含B27 (1∶50)、100 U/ ml青霉素、100μg/ml链霉素、20ng/ml EGF、20ng/mlbFGF,置于5 % CO2培养箱(37℃)内培养。细胞每5～7 d传代1次。取次代神经球离心后消化,吹打成单细胞悬液,通过“有限稀释法”获得从一个单细胞克隆扩增出的大量均质的脑干耳蜗核“神经前体细胞”。采取免疫荧光、免疫组织化学的方法,对NSCs/NPCs的特异性标记物Nestin、Musashi1的表达进行鉴定;通过台盼蓝染色技术检测不同日龄组细胞活力;CCK-8法绘制不同日龄组生长曲线,观察不同生长因子对于细胞增殖的影响。结果:新生5-7日龄大鼠脑干耳蜗核可以分离培养“神经前体细胞”,体外培养可以形成神经球,并保持旺盛的增殖活力,可持续传代100代以上;这些细胞经稀释纯化、传代后可以继续形成细胞克隆。细胞克隆呈nestin、musashil1免疫反应阳性;5-7日龄大鼠脑干耳蜗核中“神经前体细胞”数量较多,增殖能力旺盛,而在小于5日龄与大于9日龄大鼠中该细胞数量很少,而且增殖能力差,很难连续传代。表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用可以明显促进耳蜗核中的“神经前体细胞”的传代、增殖。结论:从新生5-7日龄大鼠脑干耳蜗核可以分离、培养出具有长期自我更新、维持自身数量稳定、保持未分化状态进行传代分裂增殖的具有部分NSCs特性的“神经前体细胞”。实验二:新生大鼠脑干耳蜗核神经前体细胞体外分化特性的对比研究目的:在实验一中,我们在新生5-7日大鼠的脑干耳蜗核中分离出了具有体外连续传代增殖能力的“神经前体细胞”,这些细胞体外培养可以形成神经球,并表达NSCs/NPCs的特异性抗体,但还没有证实其是否存在NSCs/NPCs的另一个重要的特性——多向分化潜能。本实验拟通过免疫组织化学、免疫荧光、分子生物学的方法,验证该细胞的体外多向分化能力,观察分析其分化特性,并比较其与嗅球NSCs、嗅上皮NSCs分化特性的差异。方法:三种细胞分别取材培养,进行体外诱导分化后免疫细胞化学、免疫荧光化学以及分子生物学的鉴定;进行细胞的BrdU的体外标记,观察增殖与分化情况。结果:我们的实验结果提示大部分细胞分化为NeuN免疫反应阳性的神经元和GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞,少部分细胞分化为GalC免疫反应阳性的少突胶质细胞;标记后大部分细胞均为BrdU阳性,表明其处于增殖期,通过对三种来源细胞BrdU阳性率的比较可以发现,嗅球来源与耳蜗核来源的细胞BrdU的阳性率相近,均高于嗅上皮来源的NSCs。这可能由于不同脑区的发育特性导致其干细胞增殖能力不同。结论:新生大鼠脑干耳蜗核中的这种“神经前体细胞”具有了体外多向分化的潜能。实验三:新生大鼠脑干耳蜗核神经前体细胞的超微结构研究目的:了解大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”的超微结构、细胞之间的联系以及细胞的增殖和发育状态,有助于阐明该细胞在体外培养条件下的生长、发育和分化等生物学行为,为该细胞的研究和应用奠定基础。方法:本研究在成功分离、培养新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”的基础上,应用扫描及透射电子显微镜观察新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”的超微结构,进一步研究新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”的生物学特征,以期为更深层次的研究和应用提供依据。结果:体外培养的NSCs呈圆形或椭圆形,表面有微突起或微绒毛,细胞核浆比例高,稀少的细胞浆中有多少不等的未成熟线粒体、核糖体及高尔基复合体。不同培养时期的神经球内未分化NSCs的结构大致相同,均有分裂增殖细胞及少数凋亡细胞。分化后细胞伸出树突、轴突样结构,相邻细胞之间有突触样组织。结论:电镜提示耳蜗核“神经前体细胞”具有原始细胞的形态和结构,分化后的细胞均有神经细胞的形态学特点。实验四大鼠脑干耳蜗核神经前体细胞的冻存与复苏目的:NSCs在神经组织中含量少,获取大量纯化NSCs是研究工作的基础。NSCs在体外的合理冻存与复苏及无损保存是NSCs研究的关键。建立一种能够长期储存并维持NSCs生物学特性的方法对促进神经科学的基础和临床移植的研究具有重要的意义。方法:我们应用不同冻存保护液对新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”进行冻存,研究低温冻存对该细胞的增殖及多向分化潜能的影响,并以胚胎大鼠嗅球神经干细胞作为对照进行研究,分析冻存与复苏对于新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”生物学特性的影响。结果:采取正确的冻存与复苏方法,对新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”的生物学特性无影响。结论:新生大鼠脑干耳蜗核“神经前体细胞”经低温长期冻存,复苏后对于该细胞的基本生物学特性没有明显影响,可以长期低温冻存。