胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA基因的克隆、表达及其与猪多杀性巴氏杆菌的双重PCR诊断

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zjx000a
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1.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA毒力基因的克隆和表达。参照GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae.APP)溶血素(Apx)IVA基因序列设计了一对特异性引物,PCR扩增到992bp的目的片段,将其插入pMD-18T载体中,并将连接产物转化入BL21中,转化菌入含有氨苄青霉素的LB固体培养基上,37℃培养12~16h,挑选白色菌落培养,提取质粒,经PCR和酶切鉴定,将鉴定正确的质粒测序。用EcoRⅠ和HindⅢ从克隆载体中切下目的片段,冻溶法回收酶切片段,在T4DNA连接酶的作用下重组入经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3),挑取白色菌落培养,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定,目的基因获得高效表达。 2.猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立。依据GenBank中的胸膜肺炎放线杆菌的溶血素IVA基因和巴氏杆菌的16SRNA基因设计合成了2对引物,对每个细菌PCR条件进行优化后,将两个菌进行双重PCR反应,产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见胸膜肺炎放线杆菌473bp的片段和巴氏杆菌的253bp的片段;将两个菌与金黄色葡萄球菌,肺炎双球菌,大肠杆菌,支气管败血波氏杆菌做模板进行PCR反应,其他菌不能扩增出相同的特异片段,表明应用双重PCR方法可高效和特异的检测猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌。
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