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近年来,由食源性致病菌引起的食物中毒事件及由腐败菌引起的食品保质期内腐败变质的报道频频发生,成为亟待解决的食品安全问题,因此,如何快速有效地对微生物进行实时检测成为预防及解决此类问题的关键。由于食品体系的复杂性,食源性微生物的存活方式多种多样,引起食品安全事件的方式不尽相同,如由于大肠杆菌群菌落数超标而引起的食品污染事件,或由携带毒素基因的某类微生物在适当条件下产毒导致的食物中毒事件,以及由某类微生物中的特定基因导致的食品腐败变质等事件。而现行的针对食源性微生物的检测方法多受到检测设备昂贵、耗时长、灵敏度低等方面的限制,因此本课题以食源性致病菌金黄色葡萄球菌10071和12513,阪崎肠杆菌BAA 894和s-3,及食源性腐败菌耐酸乳杆菌BM-LA14527为研究对象,通过分别分析及比较各基因组及转录组信息,筛选针对各微生物不同特性的检测靶点,同时基于RCA技术,针对各靶点建立RCA反应体系,进一步构建基于RCA扩增的SPR传感器检测体系,以实现对食源性微生物快速、精确、高通量地实时检测。1.本实验以两株金葡菌、两株阪崎肠杆菌及一株耐酸乳杆菌为研究对象,利用Illumina Hiseq 2500测序平台对金葡菌及阪崎肠杆菌进行全基因组的De novo测序,通过SOAPdenovo组装软件及RAST、GeneMarks等基因预测注释工具,得到组装结果较好的基因组序列,包括金葡菌10071的226条scaffold,12513的84条scaffold,阪崎肠杆菌BAA 894的135条scaffold及s-3的1,734条scaffold。经预测发现,金葡菌10071及12513分别由2603及2503个CDS,而阪崎肠杆菌BAA 894及s-3中分别由3980及2420个CDS;同时,基于COG及KEGG等数据库,利用BLAST比对工具,注释得到各基因序列的COG功能分类及KEGG代谢通路富集情况。2.利用RNA-seq技术对培养24 h的两株阪崎肠杆菌生物被膜进行转录组测序,基于本实验室前期研究基础及GenBank数据库,获得不同浓度抗生素条件下金葡菌的转录组,及特殊增殖状态下耐酸乳杆菌的转录组。3.利用比较基因组学及转录组学相关技术,包括各微生物基因组间同源序列分析,及基于NR、VFDB及CARD等数据库对同源序列的预测及注释,获得两株金葡菌的同源序列2513条,两株阪崎肠杆菌的同源序列2026条。对其注释分析,发现金葡菌同源序列中毒力相关基因共70个,相似度达到100的耐药基因有12个;而阪崎肠杆菌同源序列中毒力相关基因有247个,且未发现耐药基因。进一步对同源序列注释结果进行分析,结合序列本身特异性及相关食品安全事件的发生原因,筛选出金葡菌的肠毒素基因seb、sec、剥脱毒素及因eta及与耐药相关的mecA基因,阪崎肠杆菌的特异性序列ESA02130及与致病性相关的ompA基因,和耐酸乳杆菌致腐败相关基因horA做为检测靶点。4.对筛选出的检测靶点设计锁式探针,基于恒温扩增原理,建立针对各检测靶点的RCA扩增体系,并对其特异性进行检测,发现所建立RCA检测体系具有较高的特异性;进而基于RCA扩增体系建立SPR传感器检测体系,利用SPR四孔晶片,对金葡菌3种毒素相关基因的同时检测,发现检测结果均呈阳性,该结果与组学分析结果及RCA检测结果一致,证实了利用组学分析技术实现对微生物相关特性全面高通量检测的可行性;同时对阪崎肠杆菌ESA02130及ompA基因进行检测,以10071作为阴性对照,双蒸水做空白对照,结果显示该反应体系具有较高的特异性;对反应体系及反应过程进行分析发现,RCA-SPR检测体系不超过6μL,反应时间不超过20 min,大大缩短了,降低了反应成本,同时可实现实时检测。