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研究目的:在课题组前期研究的基础上,利用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印迹技术(Western blotting)从mRNA和蛋白水平分析fancd2os基因在睾丸组织不同细胞系中的表达谱;通过免疫组织化学和免疫荧光染色分析FANCD2OS蛋白在睾丸组织中的细胞定位;并进一步建立过表达fancd2os基因的HEK293T细胞模型,从细胞水平深入探讨fancd2os基因的潜在功能。研究方法:1.通过实时定量PCR分析fancd2os mRNA在精原细胞(GC1-spg)、精母细胞(GC2-spd)、睾丸Leydig间质细胞(TM3)、睾丸Sertoli支持细胞(TM4)四种细胞系中的表达;2.运用Western blotting方法检测FANCD2OS蛋白在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四种细胞系的表达;3.利用免疫组织化学和免疫荧光染色分析FANCD2OS蛋白在睾丸组织中的细胞定位;4.建立fancd2os基因过表达的HEK293T细胞模型,分别利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blotting检测fancd2os基因的过表达情况;5.采用CCK8方法检测过表达fancd2os基因对HEK293T细胞增殖能力的影响;6.利用Western blotting检测过表达fancd2os基因后HEK293T细胞Caspase3蛋白的水平;7.运用Caspase3荧光染色试剂盒对紫外诱导后HEK293T细胞凋亡状况进行分析;8.运用流式细胞术检测过表达fancd2os基因对紫外诱导HEK293T细胞凋亡、线粒体膜电位水平的影响。研究结果:1.实时定量PCR结果显示fancd2os mRNA在四种细胞系中均有表达,但是在TM3中的表达水平相对较高;2.Western blotting结果显示FANCD2OS蛋白在四种细胞中都有表达,在TM3中的表达水平相对较高;3.免疫组织化学和免疫荧光染色均发现FANCD2OS蛋白主要定位在睾丸间质细胞中;4.RT-PCR和Western blotting分析显示在HEK293T细胞模型中检测到fancd2os基因的过表达;5.CCK8结果表明转染重组质粒的HEK293T细胞增殖能力明显高于空载体组和裸细胞组(p<0.05);6.Western blotting结果显示过表达组活化型Caspase3含量明显高于其余两组;7.荧光染色实验发现转染组的Caspase3荧光阳性信号明显多于空载体组和对照组;8.流式细胞术分析表明过表达组的细胞凋亡程度明显高于空载体组和裸细胞组(p<0.01),线粒体膜电位下降的百分比明显高于空载体组和裸细胞组(p<0.05)。研究结论:1.fancd2os基因在GC1-spg、GC2-spd、TM3、TM4四种细胞系中均有表达,但在TM3中的相对表达水平较高;2.fancd2os基因过表达可以抑制HEK293T细胞的增殖能力,降低线粒体膜电位,使细胞内激活型Caspase3蛋白水平增高,对细胞凋亡具有促进作用。