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铅是一种普遍存在于环境水体中对生物体毒性很强的金属。目前,关于铅胁迫下对莱茵衣藻的研究主要集中于金属螯合肽对铅的解毒作用、铅离子的生物积累、吸附及其转运等。然而,有关莱茵衣藻在铅胁迫下的生理生化特征、分子生物学响应机制等却鲜见报道。因此,本研究选择莱茵衣藻为材料,采用生理生化指标检测、转录组学分析等手段,分析莱茵衣藻在铅胁迫下的生理生化特征,探讨铅胁迫下的信号调控网络、内质网质量控制及其协助降解调控机制。研究成果将有助于深入解析莱茵衣藻在铅胁迫下的生理生化响应及分子生物学响应机制,为进一步了解微藻在重金属胁迫下的调控机制奠定理论基础。
本研究以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为实验材料,设置了不同浓度的硝酸铅胁迫的实验组(对照组0μmol.L-1,低铅胁迫组3μmol.L-1,高铅胁迫组80μmol.L-1),处理时间为7天。结果发现,低浓度的铅胁迫对莱茵衣藻的细胞密度、叶绿素含量、最大光合效率(Fv/Fm)、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)等生理生化指标均没有显著影响(P>0.05)。然而,在高浓度铅胁迫下,莱茵衣藻的细胞密度、最大光合效率(Fv/Fm)、总叶绿素含量以及可溶性蛋白的含量均被显著地抑制;抗氧化物酶活性(POD、CAT、SOD)显著增强,丙二醛大量积累。这些结果表明,在高浓度铅胁迫下莱茵衣藻的活性被显著抑制,抗氧化物酶系统的激活可以缓解金属铅的胁迫。
为进一步了解莱茵衣藻在铅胁迫下的分子响应机制,本研究借助转录组学等生物信息学技术进行了研究。通过6个样品的转录组测序,共获得56.84GbCleanData,各样品CleanData均达到8.64Gb,Q30碱基百分比在93.46%及以上,测序可信度高。在对照组vs低铅胁迫组,只检测到66个差异表达基因,其中40个基因上调,26个基因下调。在对照组vs高铅胁迫组,检测到了2630个差异表达基因,其中1866个基因上调,764个基因下调。KEGG代谢途径注释结果发现,ABC转运蛋白(ABC transporters),过氧物酶体(Peroxisome),谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)等途径的基因表达显著上调。这些结果进一步在分子水平上验证了高铅胁迫下莱茵衣藻的生理生化特征变化。此外,总共检测到了67个与植物激素信号调控网络相关的差异表达基因,但并未检测到与钙调信号以及MAPK信号调控网络相关的差异表达基因。因此,我们推测莱茵衣藻在高铅胁迫下的生理生化及抗氧化防御响应可能主要是由植物激素信号调控网络介导的。
在弄清了莱茵衣藻在铅胁迫下的主要信号调控网络的基础之上,本课题进一步对莱茵衣藻的内质网质量控制(ERQC)和协助降解调控(ERAD)机制进行研究。结果发现,在高铅胁迫下,莱茵衣藻的内质网质量控制和内质网协助降解调控途径被激活。与内质网质量控制(ERQC)相关的STT3B,ALG14和PDI基因的表达量显著上调,只有RPN1显著下调。STT3B,ALG14以及RPN1这3个基因的差异表达,导致莱茵衣藻蛋白质的糖基化修饰途径的改变,产生了特异性修饰的糖蛋白。我们推测蛋白质的特异性修饰改变蛋白质的功能,从而缓解高浓度的铅对莱茵衣藻的胁迫。此外,高铅胁迫可能引起蛋白质的错误折叠或不折叠。错误折叠或未折叠蛋白在内质网的大量积累,引起未折叠蛋白反应,导致内质网胁迫,进而调控下游的内质网协助降解途径相关基因的表达。本研究发现,与内质网协助降解调控途径(ERAD)相关的HspBP1,UBX,OTU1,Ufd2,E1B,E2Q和E3A基因表达显著上调,最终促进这些错误折叠或未折叠蛋白质的降解,减少其对莱茵衣藻细胞的毒害,维持细胞的稳态。
本研究以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为实验材料,设置了不同浓度的硝酸铅胁迫的实验组(对照组0μmol.L-1,低铅胁迫组3μmol.L-1,高铅胁迫组80μmol.L-1),处理时间为7天。结果发现,低浓度的铅胁迫对莱茵衣藻的细胞密度、叶绿素含量、最大光合效率(Fv/Fm)、可溶性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)等生理生化指标均没有显著影响(P>0.05)。然而,在高浓度铅胁迫下,莱茵衣藻的细胞密度、最大光合效率(Fv/Fm)、总叶绿素含量以及可溶性蛋白的含量均被显著地抑制;抗氧化物酶活性(POD、CAT、SOD)显著增强,丙二醛大量积累。这些结果表明,在高浓度铅胁迫下莱茵衣藻的活性被显著抑制,抗氧化物酶系统的激活可以缓解金属铅的胁迫。
为进一步了解莱茵衣藻在铅胁迫下的分子响应机制,本研究借助转录组学等生物信息学技术进行了研究。通过6个样品的转录组测序,共获得56.84GbCleanData,各样品CleanData均达到8.64Gb,Q30碱基百分比在93.46%及以上,测序可信度高。在对照组vs低铅胁迫组,只检测到66个差异表达基因,其中40个基因上调,26个基因下调。在对照组vs高铅胁迫组,检测到了2630个差异表达基因,其中1866个基因上调,764个基因下调。KEGG代谢途径注释结果发现,ABC转运蛋白(ABC transporters),过氧物酶体(Peroxisome),谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)等途径的基因表达显著上调。这些结果进一步在分子水平上验证了高铅胁迫下莱茵衣藻的生理生化特征变化。此外,总共检测到了67个与植物激素信号调控网络相关的差异表达基因,但并未检测到与钙调信号以及MAPK信号调控网络相关的差异表达基因。因此,我们推测莱茵衣藻在高铅胁迫下的生理生化及抗氧化防御响应可能主要是由植物激素信号调控网络介导的。
在弄清了莱茵衣藻在铅胁迫下的主要信号调控网络的基础之上,本课题进一步对莱茵衣藻的内质网质量控制(ERQC)和协助降解调控(ERAD)机制进行研究。结果发现,在高铅胁迫下,莱茵衣藻的内质网质量控制和内质网协助降解调控途径被激活。与内质网质量控制(ERQC)相关的STT3B,ALG14和PDI基因的表达量显著上调,只有RPN1显著下调。STT3B,ALG14以及RPN1这3个基因的差异表达,导致莱茵衣藻蛋白质的糖基化修饰途径的改变,产生了特异性修饰的糖蛋白。我们推测蛋白质的特异性修饰改变蛋白质的功能,从而缓解高浓度的铅对莱茵衣藻的胁迫。此外,高铅胁迫可能引起蛋白质的错误折叠或不折叠。错误折叠或未折叠蛋白在内质网的大量积累,引起未折叠蛋白反应,导致内质网胁迫,进而调控下游的内质网协助降解途径相关基因的表达。本研究发现,与内质网协助降解调控途径(ERAD)相关的HspBP1,UBX,OTU1,Ufd2,E1B,E2Q和E3A基因表达显著上调,最终促进这些错误折叠或未折叠蛋白质的降解,减少其对莱茵衣藻细胞的毒害,维持细胞的稳态。