论文部分内容阅读
目的:探讨电针对MCAO大鼠血管新生的调控作用,以miR-210-3p及AKT/mTOR信号通路为切入点,探讨3个时相(3 d、7 d、14 d)下电针对于miR-210-3p、AKT/mTOR通路因子相互作用的调控作用,以期进一步阐述电针调控脑缺血后血管新生的可能机制,为揭示miRNAs作为潜在作用途径的脑缺血防治提供新思路。方法:将160只清洁级雄性(Sprague Dawley,SD)大鼠随机取假手术组36只,余124只大鼠建立MCAO模型,将符合评分标准的108只大鼠随机分为3组:模型组、电针组、电针+抑制剂组(简称抑制剂组)分别36只,上述4组大鼠,再分为3 d、7 d、14 d三个时相组,每组12只。电针组选“百会”、“大椎”两穴,用0.30*25 mm毫针针刺,电针参数:疏密波,频率为5~100 Hz,电流1~2 m A,强度以引起穴位周围组织轻微颤抖为度,治疗时长为20 min。首次治疗于术后4 h开始,每日1次,分别连续治疗3 d、7 d、14 d。抑制剂组予以特异性抑制剂雷帕霉素腹腔注射,浓度为0.1 mg/ml,每次0.3 mg/kg,每日1次,再进行电针治疗(方法同电针组)。随后进行神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,m NSS)评估四组大鼠的神经功能损伤;运用激光多普勒血流仪测定插线后5 min、3 d、7 d、14 d局部脑血流量;HE染色观察脑组织病理改变;Western Blot检测AKT/p-AKT/mTOR/p-mTOR蛋白表达;RT-q PCR检测miR-210-3p、Ephrin A3、AKT、mTOR m RNA表达;运用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)测定CD31+表达,Weidner法计数缺血侧皮质区微血管密度(Microvessel Density,MVD)。结果:1.改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS)假手术组在术后四个时间段(4 h、3 d、7 d、14 d)神经功能缺损评分均为0分;模型组与电针组比较,电针组神经功能评分均低于模型组,干预7 d、14 d时较为显著(P<0.01);模型组与抑制剂组相比,干预3 d、7 d、14 d神经功能缺损程度均无统计学意义;干预14 d后,电针组与抑制剂组相比,神经功能缺损评分显著降低(P<0.01)。2.局部脑血流量(rCBF)假手术组大鼠的局部脑血流量在四个时间段下(5 min、3 d、7 d、14 d)约稳定在130 Pu左右,与假手术组相比,模型组大鼠术后四个时间段血流量均明显低于假手术组(P<0.01);与模型组相比较,电针组和抑制剂组在干预5 min、3 d时,无统计学意义(P>0.05),干预7 d、14 d时,电针组与抑制剂组局部脑血流量均明显高于模型组,具有显著性差异(P<0.05),其中7 d时具有具有极显著差异(P<0.01);电针组与抑制剂组比较,干预7 d、14 d时脑血流量均增高,7 d时具有极显著性差异(P<0.01),14 d时局部脑血流量持续增高,具有显著性差异(P<0.05)。3.脑组织病理学观察(HE染色)假手术组大鼠在3个时间段缺血侧皮质区脑组织结构完整,神经元排布有序,存在极少量空泡,细胞核清晰完整。模型组大鼠缺血侧皮质区脑组织可见大量空泡,间质水肿明显,神经元细胞排列不紧密,结构疏松呈网状,数量明显减少,大量神经元细胞凝聚。术后14 d,脑组织损伤程度较3 d、7 d进一步减轻。不同时间段下电针及抑制剂组大鼠缺血侧皮质区脑组织均有不同程度的改善。4.Western Blot检测AKT/p-AKT/mTOR/p-mTOR蛋白表达假手术组各个时间段,大鼠缺血侧皮质区有少量的AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达。与假手术组比较,模型组中p-AKT的表达在各个时间段持续增加(P<0.05),在14 d达到高峰;AKT、mTOR的表达在3 d达到高峰(P<0.01);p-mTOR的表达在7 d达到高峰(P<0.01)。与模型组比较,电针组3 d、7 d、14 d中AKT/p-AKT/mTOR/p-mTOR表达显著增高(P<0.01),AKT和p-AKT的表达在14d达到高峰,mTOR和p-mTOR的表达在各个时间明显增加(P<0.01),在7 d达到高峰;抑制剂组中各个时间Akt/p-AKT/mTOR/p-mTOR的表达降低(P<0.05)。5.RT-q PCR检测miR-210-3p/Ephrin A3及AKT/mTORm RNA表达假手术组大鼠缺血侧皮质区miR-210-3p/Ephrin A3/AKT/mTOR mRNA呈少量表达。模型组miR-210-3p/Ephrin A3/AKT/mTOR mRNA相对表达量在3 d、7 d、14d较假手术组均显著增高,且具有极显著性差异(P<0.01)。治疗3 d、7 d、14 d后,电针组miR-210-3p mRNA相对表达量较模型组均显著升高,具有极显著性差异(P<0.01),Ephrin A3 mRNA相对表达量均降低,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。抑制剂组与电针组不同时间比较,miR-210-3p mRNA相对表达量均降低(P<0.01),Ephrin A3 mRNA相对表达量均升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组、抑制剂组大鼠干预7 d、14 d后AKT/mTOR m RNA的相对表达量均显著高于模型组(P<0.05或P<0.01),电针组与抑制剂组比较,AKT/mTOR mRNA的相对表达量均显著增高(P<0.01)。6.微血管密度(MVD)测定假手术组三个时间段下仅见少量CD31+阳性表达。与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮质区脑组织中的CD31+阳性细胞数量表达均显著增高(P<0.05或P<0.01);电针组与模型组比较,CD31+阳性细胞数量表达显著增多(P<0.01),在14 d时CD31+阳性细胞数量表达达到高峰;抑制剂组与假手术组比较,3 d时无统计学意义(P>0.05),干预7 d、14 d电针组与抑制剂组CD31+阳性细胞数量表达具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.电针促进MCAO大鼠神经功能的重建、改善大脑局部脑血流量,改善MCAO大鼠缺血侧皮质区脑组织病理变化。2.电针可调节MCAO大鼠缺血侧皮质区脑组织miR-210-3p及其靶向信使Ephrin A3的表达;上调AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、CD31+相对表达,提示miR-210-3p可能特异性调节AKT/mTOR信号通路,在脑缺血恢复中促进血管新生,这可能是电针促进脑缺血后血管新生的相关机制之一。