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【目的】
1.明确外源添加抗氧化剂还原型谷胱甘肽（GSH）是否通过上调内源性抗氧化酶HO-1表达来增强肝细胞早期抗氧化应激能力，进而减轻肝细胞缺氧复氧损伤。
2.通过证实还原型谷胱甘肽增强内源性抗氧化酶的作用，推广临床上该药在肝移植、肝叶段切除患者中的应用。
【研究方法】
1.自上海SantaCruz公司购买HO-1siRNA，6孔培养板中常规接种人肝细胞HL7702,待HL7702细胞60-70%汇合后,将6ulReagent分别与100ulTransfection及6ulHO-1siRNA配成转染混合物加入细胞中，构建不同表达HO-1的肝细胞。并用Westernblot检测正常组及加入HO-1siRNA肝细胞组中HO-1表达量。
2.将不同表达HO-1肝细胞分为正常组（C）、缺氧/复氧组（HR）、还原型谷胱甘肽保护组（HR+GSH）、HO-1沉默组（HR+GSH+HO-1siRNA）并按1×105、8×103密度分别接种于6孔板及96孔板中，缺氧前换用无糖培养基，并按20mmol/L浓度在HR+GSH、HR+GSH+HO-1siRNA组中加入GSH，C、HR组加入等量PBS；使用缺氧复氧盒按缺氧6小时复氧4小时构建肝细胞缺氧复氧模型。复氧4小时后，分别收集细胞上清液及细胞。
3.复氧4h后96孔板中每组取6孔细胞，每孔加入10ulcck8溶液，放入CO2培养箱中继续孵育2h。之后取出细胞，选择450nm波长，采用酶标仪测定吸光度值，反映人肝细胞活力；另取细胞上清液，使用乳酸脱氢酶释放法检测细胞上清液中LDH含量。
4.取6孔板中肝细胞，多聚甲醛固定通透后，先后加入DAPI及DHE染剂，PBS漂洗后使用荧光显微镜观察DIPI和DHE荧光。计数每组mm2中DHE染色标记的阳性细胞数。
5.复氧4h后收集细胞培养液于Ep管中，ELISA试剂盒检测ALT、AST表达情况，TBA法检测MDA表达情况，黄嘌呤氧化酶法检测T-SOD表达情况。
6.细胞刮刮下细胞后，顺序加入细胞裂解液并经离心后获得细胞蛋白。按实验顺序上样后WesternBlot检测每组蛋白中HO-1表达差异，并检测内参蛋白GAPDH的表达。
【结果】
1.Westernblot检测不同表达HO-1的肝细胞模型，结果显示未加入HO-1siRNA的肝细胞组HO-1表达条带较加入HO-1siRNA的肝细胞组宽（P＜0.05），差异具有统计意义；提示成功构建不同表达HO-1的肝细胞模型。
2.采用CCK8法、上清LDH测定法检测不同肝细胞组的肝细胞活力，结果显示：缺氧复氧后肝细胞活力下降、上清LDH释放增加；加入GSH组对缺氧复氧肝细胞有保护作用，表现为细胞活力下降减轻、上清LDH释放减少；沉默HO-1表达后这种保护作用被减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
3.肝细胞缺氧复氧后氧化损伤增强，表现为胞内活性氧ROS生成增加，加入GSH后氧化损伤减轻，DHE染色提示活性氧ROS生成减少；而GSH对缺氧复氧肝细胞氧化损伤的保护作用随着加入HO-1siRNA而减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
4.缺氧复氧肝细胞中T-SOD消耗增加，同时MOD、AST、ALT等释放增加。加入GSH后缺氧复氧肝细胞T-SOD消耗减少，同时MOD、AST、ALT等损伤指标释放减少。GSH的保护作用随着加入HO-1siRNA后被减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
5.提取各组肝细胞总蛋白，WesternBlot结果提示缺氧复氧肝细胞中HO-1表达量较正常组增加；加入GSH后肝细胞中HO-1表达进一步增强，而加入HO-1siRNA的肝细胞组中HO-1表达减少（P＜0.05），结果有统计学意义。所有组肝细胞内参蛋白GAPDH表达量相同。
【结论】
外源添加抗氧化剂GSH能够增强缺氧复氧肝细胞早期的抗氧化应激能力，进而减轻肝细胞缺氧复氧损伤；这种保护作用可能是通过增强内源性抗氧化酶HO-1的表达来实现的。
1.明确外源添加抗氧化剂还原型谷胱甘肽（GSH）是否通过上调内源性抗氧化酶HO-1表达来增强肝细胞早期抗氧化应激能力，进而减轻肝细胞缺氧复氧损伤。
2.通过证实还原型谷胱甘肽增强内源性抗氧化酶的作用，推广临床上该药在肝移植、肝叶段切除患者中的应用。
【研究方法】
1.自上海SantaCruz公司购买HO-1siRNA，6孔培养板中常规接种人肝细胞HL7702,待HL7702细胞60-70%汇合后,将6ulReagent分别与100ulTransfection及6ulHO-1siRNA配成转染混合物加入细胞中，构建不同表达HO-1的肝细胞。并用Westernblot检测正常组及加入HO-1siRNA肝细胞组中HO-1表达量。
2.将不同表达HO-1肝细胞分为正常组（C）、缺氧/复氧组（HR）、还原型谷胱甘肽保护组（HR+GSH）、HO-1沉默组（HR+GSH+HO-1siRNA）并按1×105、8×103密度分别接种于6孔板及96孔板中，缺氧前换用无糖培养基，并按20mmol/L浓度在HR+GSH、HR+GSH+HO-1siRNA组中加入GSH，C、HR组加入等量PBS；使用缺氧复氧盒按缺氧6小时复氧4小时构建肝细胞缺氧复氧模型。复氧4小时后，分别收集细胞上清液及细胞。
3.复氧4h后96孔板中每组取6孔细胞，每孔加入10ulcck8溶液，放入CO2培养箱中继续孵育2h。之后取出细胞，选择450nm波长，采用酶标仪测定吸光度值，反映人肝细胞活力；另取细胞上清液，使用乳酸脱氢酶释放法检测细胞上清液中LDH含量。
4.取6孔板中肝细胞，多聚甲醛固定通透后，先后加入DAPI及DHE染剂，PBS漂洗后使用荧光显微镜观察DIPI和DHE荧光。计数每组mm2中DHE染色标记的阳性细胞数。
5.复氧4h后收集细胞培养液于Ep管中，ELISA试剂盒检测ALT、AST表达情况，TBA法检测MDA表达情况，黄嘌呤氧化酶法检测T-SOD表达情况。
6.细胞刮刮下细胞后，顺序加入细胞裂解液并经离心后获得细胞蛋白。按实验顺序上样后WesternBlot检测每组蛋白中HO-1表达差异，并检测内参蛋白GAPDH的表达。
【结果】
1.Westernblot检测不同表达HO-1的肝细胞模型，结果显示未加入HO-1siRNA的肝细胞组HO-1表达条带较加入HO-1siRNA的肝细胞组宽（P＜0.05），差异具有统计意义；提示成功构建不同表达HO-1的肝细胞模型。
2.采用CCK8法、上清LDH测定法检测不同肝细胞组的肝细胞活力，结果显示：缺氧复氧后肝细胞活力下降、上清LDH释放增加；加入GSH组对缺氧复氧肝细胞有保护作用，表现为细胞活力下降减轻、上清LDH释放减少；沉默HO-1表达后这种保护作用被减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
3.肝细胞缺氧复氧后氧化损伤增强，表现为胞内活性氧ROS生成增加，加入GSH后氧化损伤减轻，DHE染色提示活性氧ROS生成减少；而GSH对缺氧复氧肝细胞氧化损伤的保护作用随着加入HO-1siRNA而减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
4.缺氧复氧肝细胞中T-SOD消耗增加，同时MOD、AST、ALT等释放增加。加入GSH后缺氧复氧肝细胞T-SOD消耗减少，同时MOD、AST、ALT等损伤指标释放减少。GSH的保护作用随着加入HO-1siRNA后被减弱（P＜0.05），结果有统计学意义。
5.提取各组肝细胞总蛋白，WesternBlot结果提示缺氧复氧肝细胞中HO-1表达量较正常组增加；加入GSH后肝细胞中HO-1表达进一步增强，而加入HO-1siRNA的肝细胞组中HO-1表达减少（P＜0.05），结果有统计学意义。所有组肝细胞内参蛋白GAPDH表达量相同。
【结论】
外源添加抗氧化剂GSH能够增强缺氧复氧肝细胞早期的抗氧化应激能力，进而减轻肝细胞缺氧复氧损伤；这种保护作用可能是通过增强内源性抗氧化酶HO-1的表达来实现的。