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人类主要组织相容性抗原Ⅰ类分子包括经典HLA-A、B、C分子和非经典HLA-E、G、F分子两大类。其中非经典HLA-Ⅰ类分子在免疫系统中所起的作用目前已成为免疫学研究的热点之一。HLA-E是一类非经典的MHC-Ⅰ类分子，具有广泛的组织分布和低水平表达的特点，HLA-E分子的细胞表面表达有赖于MHC-Ⅰ类分子(HLA-A.-B.-C和-G)衍生的先导序列多肽的存在，作为NK细胞受体CD94/NKG2的配体，它调节人类自然杀伤细胞和T细胞的功能，在母胎免疫，肿瘤免疫，病毒感染的免疫逃避以及移植免疫中具有重要作用。
HLA-E的鼠源类似物为Qa-1，具有有限的多态性，广泛的组织表达，而细胞表面表达比较低。Qa-1结合一种肽，来源于H-2D，称为Qdm，共同表达于细胞表面，Qa-1-Qdm复合物可被NK细胞和一部分T细胞的CD94/NKG2所识别。与人类细胞相似，Qa-1与CD94/NKG2-A结合传递抑制信号，起抑制NK细胞的作用，与CD94/NKG2-C结合则激活NK细胞。但在小鼠细胞，CD94/NKG2-C受体的合成量少于CD94/NKG2-A，Qa-1与Qdm结合并不是唯一的，Qa-1也可与其它多肽结合而被CD94/NKG2识别，只是Qdm有最佳的结合结构。与HLA-E相似，Qa-1在调节NK细胞，T细胞功能，肿瘤免疫，病毒感染，自身免疫，移植免疫中起重要作用。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指由19～23碱基对的短双链RNA，即小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)在真核细胞中引导序列特异性的内源或外源性靶mRNA降解，进而抑制相应基因表达的现象。因其高度的特异性，高效性得到广泛应用，目前有包括化学合成法在内的几种制备方法，其中利用载体在细胞内表达可以达到使siRNA传代的目的。
综上所述，Qa-1在免疫调节中发挥重要作用，其在异基因造血干细胞移植中的作用还有待研究，利用RNA干扰这一新型高效的基因敲除技术，可以帮助我们进一步研究Qa-1在异基因造血干细胞移植中的具体作用，为临床增加干细胞植入，防治GVHD提供新策略。本课题将利用RNA这一新型高效的基因敲除技术初步筛选小鼠Qa-1最有效的干扰片段，为进一步研究Qa-1在免疫调节中的作用，进行动物实验及应用于临床异基因造血干细胞移植奠定基础。
材料和方法1.构建三个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒在GeneBank查出小鼠Qa-1mRNA全序列，通过美国Ambion公司提供的siRNAweb设计工具，依据设计原则，选择三段针对Qa-1的siRNA靶位：GACTCGGAGAATCCGAAGA；AATCAGAGTAAGGACGAATCT；AACAAAGCTGTTCTGCTTGTC分别位于186，327，929位，交由晶赛公司合成三段针对Qa-1的小发夹结构，分别在合成片段两端添加BamHⅠ及SalⅠ酶切位点，真核载体pGenesil-2经BamHⅠ，SalⅠ双酶切，与发夹结构连接，合成小发夹表达质粒，质粒带有新霉素筛选标记，卡那抗性。以紫外分光光度计测定小发夹表达质粒的浓度，纯度，并交由博亚公司酶切测序。
2.筛选出最有效抑制Qa-1基因的siRNA靶位小鼠成纤维细胞NIH3T3分为四组培养，n=6，采用脂质体转染法，前三组分别转染三个小发夹表达质粒，浓度为H2-T2311.2μg/μL；H2-T2321.3μg/μL；H2-T2330.8μg/μL，第四组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照。分别收集转染后24小时，48小时，72小时的细胞，提取RNA，经逆转录，设计特异性引物，PCR法扩增出目的片段，半定量分析Qa-1在RNA水平的改变，同样收集转染后24小时，48小时，72小时的细胞，通过流式细胞技术，应用抗Qa-1的特异性单抗对Qa-1的细胞表面表达进行分析。
结果1.构建三个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒通过美国Ambion公司提供的siRNAweb设计工具，得到多条siRNA靶位序列，依据设计原则，选取三条，交由武汉晶赛公司合成小发夹表达质粒，利用紫外分光光度计测定质粒的浓度，纯度，浓度为H2-T2311.2μg/μL；H2-T2321.3μg/μL；H2-T2330.8μg/μL，将质粒交付博亚公司鉴定测序，结果与所选取片段序列一致。
2.筛选最有效抑制Qa-1基因的siRNA靶位体外培养的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞贴壁生长，呈梭形或菱形，带有干扰片段的质粒转染后细胞形态发生变化，部分变圆，通过RT-PCR及流式细胞仪技术，证实转染前NIH3T3细胞表达一定水平Qa-1，转染后Qa-1在RNA水平及细胞表面均减低了表达，24h，48h，72h三组细胞Qa-1减低分别达H2-T231：60.9％，81.9％，43.6％；H2-T232：64.5％，73.9％，61.1％；H2-T233：61.9％，71.2％，47.5％.减低的程度不一，其中H2-T232组在三个时间点减低最明显。
结论1.通过设计工具，依据设计原则，选择三段针对Qa-1的siRNA靶位，在真核载体pGenesil-2上成功构建Qa-1特异性的小发夹表达质粒。
2.用脂质体转染法将构建的小发夹表达质粒成功导入体外培养的NIH3T3细胞，经RT-PCR技术及流式细胞技术筛选得到最有效抑制Qa-1基因的干扰质粒。