论文部分内容阅读
目的：研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)后适应对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法：1.H9c2细胞的培养及缺氧复氧损伤模型的建立大鼠H9c2细胞株,按常规贴壁细胞培养方法接种于含体积分数为10%南美胎牛血清的DMEM培养基中,在温度为37℃、CO2浓度为5%饱和湿度的培养箱中常规培养。2-3d换液并传代一次。将大鼠H9c2细胞用模拟缺氧液置换正常培养液,预先经95%N2+5%CO2的混合气饱和10min,然后放入通有95%N2+5%CO2的3℃7培养箱缺氧培养16h;复氧时将缺氧后的心肌细胞换用预先用95%空气+5%CO2饱和的含药DMEM低糖培养基,在正常培养条件下培养4h,建立缺氧/复氧损伤模型。2.S1P后适应对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用将培养的大鼠H9c2细胞随机分为5组,即(1)正常组；(2)缺氧/复氧(H/R)组；(3)S1P低浓度(L)组；(4)S1P中浓度(M)组；(5)S1P高浓度(H)组。开始缺氧时正常组换无血清培养基继续培养；(H/R)组缺氧培养16h,复氧4h;其余各组则在复氧前加入相应浓度的药物复氧4h,终浓度分别为2mM,4mM,6mM。3.S1P后适应对大鼠H9c2细胞缺氧复氧损伤保护作用机制的研究光学显微镜观察细胞形态的变化：MTT法检测细胞存活率；流式细胞术分析测定细胞凋亡率；比色法测定细胞培养液中总超氧化物歧化酶(Total Super Oxide Dismutase, T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(Copper/Zinc Super Oxide Dismutase, CuZn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Manganese Super Oxide Dismutase, Mn-SOD)活力以及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量；荧光显微镜下观察钙离子浓度；Western Blot测定H9c2细胞HSP70蛋白的表达水平。结果：1.H9c2细胞呈长梭形,折光率较好,进行缺氧复氧损伤后,细胞出现皱缩、破裂,与正常组相比,缺氧复氧损伤组细胞在缺氧16h复氧4h后存活率显著降低,且降低程度适中、稳定,实验结果重复性好,确定后续实验采用此模型。2.H9c2细胞存活率：与正常组相比,H/R组细胞的存活率明显降低(68.72%±6.02%vs100%±0%,P<0.01)；S1P低、中、高各个浓度干预组存活率比H/R组有明显升高,损伤明显减轻(73.90%±10.77%vs68.72%±6.02%,80.15%±9.78%vs68.72%±6.02%,80.85%±9.50%vs68.72%±6.02%,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。3.细胞培养液中MDA含量：与正常组比较,H/R组的MDA含量明显升高/(2.55nmol/L±0.132nmol/L vs1.37nmol/L±0.097nmol/L,P<0.01);与H/R组相比,S1P低、中、高各个浓度组均显著降低MDA含量(1.98nmol/L±0.125nmol/L vs2.55nmol/L±0.132nmol/L,1.71nmol/L±0.095nmol/L vs2.55nmol/L±0.132nmol/L,1.67±0.193nmol/L vs2.55±0.132nmol/L,P<0.01,P<0.01, P<0.01).4.细胞培养液中T-SOD活力：与正常组比较,H/R组的T-SOD活力明显降低(11.18U/ml±1.15U/m1vs21.14U/ml±1.33U/ml,P<0.01);与H/R组相比,S1P低、中、高各个浓度组均显著升高T-SOD活力(14.00U/ml±0.89U/ml vs11.18U/ml±1.15U/ml,17.77U/ml±1.60U/ml vs11.18U/ml±1.15U/ml,18.45U/ml±1.52U/ml vs11.18U/ml±1.15U/ml,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。细胞培养液中CuZn-SOD活力：与正常组比较,H/R组的CuZn-SOD活力明显降低(5.61U/ml±0.25U/ml vs11.87U/ml±0.61U/ml,P<0.01);与H/R组相比,S1P低、中、高各个浓度组均显著升高CuZn-SOD活力(7.06U/ml±0.70U/ml vs5.61U/ml±0.25U/ml,8.66U/ml±0.04U/ml vs5.61U/ml±0.25U/ml,8.98U/ml±0.42U/ml vs5.61U/ml±0.25U/ml,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。细胞培养液中Mn-SOD舌力：与正常组比较,H/R组的Mn-SOD(?)力明显降低(5.56U/ml±1.12U/ml vs9.27U/ml±1.07U/ml,P<0.01);与H/R组相比,S1P低、中、高各个浓度组均显著升高Mn-SOD舌力(6.95U±ml±0.98U/ml vs5.56U/ml±1.12U/ml,9.11U/ml±1.58U/ml vs5.56U/ml±1.12U/ml,9.46U/ml±1.59U/ml vs5.56U/ml±1.12U/ml,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。5.细胞内游离钙离子荧光强度的测定：正常组的细胞荧光强度维持在62.04±1.61水平；当缺氧复氧损伤后,H/R组细胞荧光强度明显增高,与正常组比较具有显著性差异(82.65±2.21vs62.04±1.61,P<0.01)。加入S1P干预后,SIP低、中、高各个浓度组的细胞荧光强度均有所降低(77.76±0.45vs82.65±2.21,72.97±0.97vs82.65±2.21,69.96±2.02vs82.65±2.21,P<0.01,P<0.01,P<0.01)。6.流式细胞术分析测定细胞凋亡率：正常组的H9c2细胞发生凋亡较少,H/R组细胞凋亡比较正常组有显著增加(20.2%±9.37%vs5.6%±3.27%,P<0.01);经过S1P低、中、高各个浓度组较H/R组的凋亡率有所下降(13.7%±11.78%vs20.2%±9.37%,10.5%±8.66%vs20.2%±9.37%,10.1%±7.39%vs20.2%±9.37%,P<0.05,P<0.01,P<0.01),表明不同浓度的S1P均能有效抑制缺氧复氧损伤所造成的H9c2细胞凋亡。7.HSP70蛋白的表达：与正常组比较,H/R组的HSP70蛋白表达明显增多；与H/R组比较,S1P各浓度组的HSP70蛋白表达明显增加。结论：1.缺氧复氧损伤对H9c2细胞的增殖有较强的抑制作用,并且呈现一定浓度和时间依赖性。在缺氧16h复氧4h时,损伤适中,结果稳定,重复性好,适用于损伤模型。2.S1P能够使缺氧复氧损伤的H9c2细胞凋亡率降低,且呈一定的浓度依赖性。3.S1P对缺氧复氧损伤的H9c2细胞凋亡的保护作用可能与降低细胞内MDA含量及细胞内钙离子浓度,提高细胞内SOD活力,增强抗凋亡蛋白HSP70的表达有关。