microRNA(miRNA,miR)是一类小分子非编码单链RNA,长约22个核苷酸,广泛存在于植物、线虫以及人类的细胞中,目前认为miRNA可以通过与靶基因m RNA3’UTR区域结合,介导靶基因m RNA的降解或抑制靶基因转录后水平的表达,从而参与并调控时序发育、细胞凋亡、细胞分化、激素分泌等多种生理过程及多种疾病发生过程。许多科学家发现miRNA在先天性心脏病中扮演着较为重要的角色,而心脏被认为是胚胎发育过程中最早形成并发挥功能的重要器官,它的形成与发育需要各种遗传调控程序在时间和空间上进行复杂而精密的相互协调,并涉及众多相关基因的顺序表达及多条信号通路的准确调控。因此,我们可以从基因和分子水平探索胚胎心脏形成及发育机制,以了解先天性心脏病发生的可能机制。本课题组前期对室间隔缺损胎儿心室肌组织进行miRNAs生物芯片筛选发现miR-30c表达明显上调,提示miR-30c在心脏发育过程中可能起着重要的作用。miR-30c属于miR-30家族,其在进化上高度保守,并且相关研究表明miR-30c参与心肌基质的重构,于是miR-30c给我们提供了关于心脏发育研究的崭新思路。现已知,shh信号转导通路,是一个高度保守的、从果蝇到脊椎动物中都存在的、与中轴器官发育相关的形态发生通路,参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程,因此本实验通过改变miR-30c的表达水平,以P19细胞为模型,模拟心肌细胞发育过程,观察其对心脏发育过程可能产生的影响。研究总共分为二部分,分别阐述miR-30c过表达、沉默对P19细胞增殖、凋亡以及miR-30c通过作用于shh信号通路对细胞分化产生的影响,探讨其在胚胎心脏发育中的作用及致畸的可能机制。第一部分miR-30c过表达/沉默对P19细胞增殖、凋亡的影响目的:通过构建miR-30c过表达/沉默质粒,分别转染P19细胞,获得miR-30c表达上调及表达沉默的稳定株,观察其对P19细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法:设计并构建miR-30c过表达以及沉默载体质粒,将其与空白对照载体分别转染P19细胞,观察转染效率,并用杀稻瘟菌素筛选14d,应用实时荧光定量PCR法验证过表达稳定株,双荧光素酶报告系统验证沉默表达稳定株。采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞仪检测miR-30c过表达/沉默对P19细胞周期的影响,并用磷脂酰外翻法及Hochest染色等方法分析其对细胞凋亡的影响。结果:成功构建并验证了miR-30c过表达及沉默的稳定细胞株。miR-30c过表达能够明显促进P19细胞进入S期,具有促进P19细胞株增殖的作用,而miR-30c沉默能够明显抑制P19细胞进入S期,具有抑制P19细胞株增殖的作用;而miR-30c过表达对其凋亡无明显影响,miR-30c沉默具有促进P19细胞凋亡的作用。结论:miR-30c过表达具有促进P19细胞增殖作用。miR-30c沉默具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。第二部分miR-30c过表达/沉默通过shh信号通路对P19细胞向心肌样细胞分化功能的影响目的:研究miR-30c过表达/沉默通过shh信号通路对P19细胞向心肌样细胞分化功能的影响。方法:体外培养miR-30c过表达/沉默稳定细胞株,用1%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导培养细胞10天使其分化成为心肌样细胞,倒置显微镜观察细胞分化形态改变。应用荧光定量PCR法检测miR-30c过表达/沉默对P19细胞分化中关键基因的变化、免疫荧光对靶基因进行定位。利用应用荧光定量PCR法、Western blot法检测shh信号通路相关基因、蛋白的表达水平。结果:细胞分化过程中,心肌分化相关标志基因在miR-30c过表达组中明显低于对照组,在miR-30c沉默组中也明显低于对照组,miR-30c过表达/沉默均抑制了心肌分化的进程。检测shh信号通路中的关键基因(shh,Gli2,Ptch,Smo),miR-30c过表达组,shh基因要高于对照组,其配体Ptch2显著增高,下游基因Smo也高于对照组,其靶基因Gli2在诱导后期也高于对照组;miR-30c沉默组,shh基因在诱导后期显著升高,其配体Ptch2显著下降。结论:miR-30c过表达/沉默均抑制心肌样细胞分化过程;其机制可能为miR-30c过表达通过与靶基因Gli2结合,抑制了整个shh信号通路,而miR-30c沉默后,解除对Gli2的抑制,激活了shh信号通路。shh信号通路的过度激活或抑制打破了发育平衡,导致细胞无法发育成正常的心肌细胞。