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植物在整个生命过程中不断受到多种病原菌的侵害。根据侵害方式的不同,植物病原菌可以分为腐生型病原菌、寄生型病原菌,以及兼具以上两种侵害方式的半寄生型病原菌。目前,人们对于植物对腐生型病原菌防御机制的认识多基于模式植物拟南芥与病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)或芸苔链格孢菌(Alternaria brassicicola)的互作研究,而在重要的蔬菜作物和模式植物番茄中,茄科链格孢菌AAL(Alternaria alternataf.sp.Lycopersici)引起的茎枯病和灰霉菌引起的灰霉病都是生产中亟待解决的农业病害。因此,以番茄为材料,研究植物对这两种病害的防御机制不仅对分析植物与腐生型病原菌互作机制具有重要意义,而且有助于建立依赖于植物自身抗性的环境友好型农业病虫害控制策略。 本研究以番茄与链格孢菌的主要致病因子AAL toxin及灰霉菌的相互作用为实验体系,综合运用蛋白组学、遗传学、分子生物学、生物化学、染色质免疫共沉淀测序等技术,研究茉莉酸(jasmonic acid,JA)途径的受体COI1(coronatine-insensitive1,COI1)以及转录因子MYC2所介导的抗病反应的调控机制。主要研究结果如下: 1、AALtoxin能够诱导番茄叶片的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),受体COI1介导的JA途径可通过调控植物叶片的氧化还原状态、其他激素途径以及PCD相关元件来调控AALtoxin诱导的细胞死亡。采用iTRAQ(isobaric tags for relative andabsolute quantitation,iTRAQ)蛋白组学技术,对毒素处理后的番茄JA受体突变体jai1(JAinsensitive1,jai1)及其野生型进行了蛋白组学分析。共鉴定到10367个蛋白,其中包含2670个差异蛋白。首先,茉莉酸受体的突变在蛋白组水平上显著改变了植物对AAL toxin的防御响应。其次,通过比较毒素处理前后野生型的蛋白组以及毒素处理后jai1及其野生型的蛋白组,鉴定到大量参与真菌毒素响应以及JA途径相关的潜在组分,不仅包括氧化还原响应、神经鞘脂合成、植物激素JA、乙烯(ethylene,ET)、水杨酸(salicylic acid,SA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)等途径中的相关组分,还包括自噬反应、PCD相关的蛋白,有利于更加深入地理解真菌毒素诱导的植物细胞PCD过程。 2、番茄中JA信号转导途径在抵御灰霉病过程中起正向调控作用。JA受体突变体jai1表现出对灰霉菌更加敏感的表型,且jai1中受伤反应基因TD(THREONINE DEAMINASE)及抗病反应基因PR-STH2的表达水平与野生型相比也显著降低,明确了COI1介导的JA信号转导途径对灰霉菌抗性的正向调控作用。转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据表明,灰霉菌侵染后,植物激素茉莉酸、乙烯、脱落酸途径的信号转导组分、PCD相关组分以及ROS组分在野生型中都发生了上调。但在jai1突变体中,茉莉酸、乙烯以及脱落酸路径的基因与野生型相比都发生了下调,且与植物对AAL toxin响应相一致的是,ROS相关组分在jai1突变体中均发生了下调,说明这些途径中的基因可能位于COI1的下游,参与了JA介导的植物对灰霉菌的抗性响应。 3、不同于拟南芥中同源基因AtMYC2的功能,番茄中bHLH(basic helix loop helix)类的转录因子MYC2在JA介导的对灰霉菌的防御过程中起着重要的正向调控作用,且MYC2可能通过次级转录因子来间接调控下游抗性基因的表达。酵母双杂和荧光素酶互补实验结果表明,MYC2能够与番茄中的11个JAZ蛋白互作,且MYC2的表达水平受到灰霉菌的诱导。灰霉菌侵染后,MYC2-RNAi以及MYC2-SRDX转基因植株中的抗性基因表达水平与野生型相比都发生了显著降低,且均表现出对灰霉菌更加敏感的表型,表明JA途径的关键转录因子MYC2在番茄防御灰霉菌的过程中起着正向调控作用。MYC2过表达能够恢复拟南芥myc2-2突变体中JA对根长的抑制作用以及JA对受伤响应基因AtVSP1的诱导,但却不能负向调控病原响应基因AtPDF1.2的转录水平,表明MYC2在拟南芥和番茄中的功能发生了分化。结合染色质免疫共沉淀测序和转录组测序技术分析了MYC2的靶标基因,将表达量在MYC2-RNAi植株中受到影响,同时又能被MYC2直接结合的基因进行了归纳,其中鉴定到了50个转录因子,对这50个转录因子的表达模式进行分类,发现NAC类的转录因子JA2L可能介导了MYC2对伤害响应基因TD的调控,ERF(ETHYLENE RESPONSIVE FACTORS)类的转录因子ERF1D可能介导了MYC2对病原响应基因PR-STH2的调控,从而阐明了MYC2对灰霉菌抗性的重要作用和调控机制。