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背景
近年来，全世界真菌感染的发病率逐年上升，给健康问题带来巨大挑战。白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans，CA)是人体感染中最常见的机会性真菌病原体，可在易感宿主中引起具有高死亡率风险的血液感染。目前临床上可用的抗真菌药物有限，而且大多也有一些严重的不良反应。此外，由于抗真菌药物的广泛使用，耐药性的出现也限制了患者的成功治愈。现如今，联合用药日益成为一种临床治疗方法，其可以使抗真菌药物的疗效增强、病原菌的耐药性和毒性降低。白色念珠菌中的HDAC具有参与调控细胞生长、毒力因子和耐药性等作用。帕比司他(Panobinostat，Pano)是组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制剂，具有抗肿瘤作用。关于Panobinostat与氟康唑(Fluconazole，FLC)联用对白色念珠菌是否具有活性抗菌作用，有待研究。
目的
探索Pano联合FLC的情况下，对白色念珠菌的体外抗菌活性，对动物模型的体内抗菌作用，并探索Pano与FLC联用时与协同作用可能相关的抗菌机制。
方法
为了评价Pano与FLC联用对白色念珠菌的体外抗菌活性，根据美国临床和实验室标准协会规定的M27-A3文件(CLSI，M27-A3)，采用微量肉汤稀释法测定Pano与FLC单用和联用时对抗白色念珠菌浮游菌的最低抑菌浓度(MIC)，用分数抑制浓度指数(FICI)模型分析药物组合的相互作用;采用XTT比色法测定Pano和FLC对白色念珠菌生物膜的联合抗真菌活性。
为了评价Pano与FLC联用对白色念珠菌的体内抗菌活性，建立了大蜡螟幼虫生物侵染模型。在不同药物组别干预后，测定受感染幼虫的存活率、真菌载菌量和组织病理学研究，以评价Pano与FLC联用在体内的抗真菌效果。
为了探讨Pano与FLC联用的潜在抗真菌机制，在显微镜下观察了药物干预对念珠菌菌丝生长的抑制作用;通过测定Pano对荧光底物罗丹明6G(Rh 6G)吸收和外排的影响，探讨了药物干预对药物转运体的影响;通过荧光探针FITC-VAD-FMK在显微镜下观察了药物干预对白色念珠菌凋亡的影响，进一步阐明Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌的潜在抗菌机制。
结果
(1)Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌浮游细胞表现出协同抗菌作用
当Pano与FLC结合使用时，可以将FLC的MIC值从≥512μg/mL降低到0.25-0.5μg/mL，FICI值为0.0024-0.0166，远小于0.5，表明Pano与FLC联合对耐药白色念珠菌有很强的协同抗菌作用。
(2)Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌生物膜表现出协同抗菌作用
对白色念珠菌4h，8h时形成的生物膜，Pano将FLC的sMIC值从≥512μg/mL降低到0.5-2μg/mL，FICI值为0.0049-0.0635。因此，对于早期的生物膜细胞(≤8h)，Pano联合FLC显示协同作用。而Pano和FLC的组合对12h和24h时形成的生物膜呈无关作用。
(3)Pano与FLC联用在大蜡螟幼虫体内呈现协同抗菌作用
在生存率变化实验中，对照组、Pano单独组和FLC单独组无显著性差异，生存率分别为10％、20％和35％(P＞0.05)，而Pano和FLC联合应用可使生存率提高到80％(P＜0.05)。在真菌载菌量实验中，Pano联合FLC可显著减少大蜡螟幼虫体内白色念珠菌的数量。在组织病理损伤实验中，与其他组相比，联合用药组的菌落数量和面积大大减少，组织损伤明显减少。
(4)Pano与FLC联用可抑制耐药白色念珠菌的菌丝生长
用RPMI-1640培养基诱导白色念珠菌菌丝生长，经药物干预后用显微镜观察。结果显示对照组形成长而交错的菌丝，单药组与对照组相比几乎无明显差异。而联用组中菌丝细胞的数量明显减少，菌丝长度也有变短。结果表明，Pano联合FLC可抑制耐药白色念珠菌菌丝生长。
(5)Pano对耐药白色念珠菌的药物吸收和外排没有影响
与对照组相比，无论对于Rh6G的吸收和外排，Pano药物干预组的结果均无显著性差异(P＞0.05)。可以推断，Pano和FLC联合对药物转运蛋白的调节没有影响。
(6)Pano与FLC联用激活细胞内的metacaspase酶，从而诱导真菌细胞凋亡
Metacaspase酶的激活是细胞凋亡的主要因素，可引起细胞形态学改变和DNA断裂从而导致死亡。FITC-VAD-FMK具有穿透细胞膜并结合metacaspase酶从而产生荧光的能力，可用于观测本试验中metacaspase酶的激活情况。通过倒置荧光显微镜观察，图像显示，Pano+FLC联用组的细胞数量比其他组少，并且显示亮绿色荧光。相反，对照组和药物单用组的细胞数目多且不显示荧光。此外，通过计算荧光细胞数目与总细胞数目的比例，表明联用组中荧光细胞的比例也远高于其他组。结果表明，Pano与FLC联用激活细胞内的metacaspase酶，从而诱导真菌细胞凋亡。
结论
总之，本研究表明Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌的浮游细胞和生物膜都有协同抗菌作用。此外，Pano与FLC联用延长了被白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫的寿命，并且减轻了幼虫的真菌载菌量和组织损伤。机制研究表明，Pano与FLC联用可以抑制白色念珠菌的菌丝生长，可以激活metacaspase酶从而诱导细胞凋亡。本研究从白色念珠菌的代谢通路以及抗真菌药物潜在靶点出发，探讨可能的药物联合效果，希望这些发现可以为克服真菌耐药提供见解，并且可以有助于新的抗真菌辅助用药的开发。
近年来，全世界真菌感染的发病率逐年上升，给健康问题带来巨大挑战。白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans，CA)是人体感染中最常见的机会性真菌病原体，可在易感宿主中引起具有高死亡率风险的血液感染。目前临床上可用的抗真菌药物有限，而且大多也有一些严重的不良反应。此外，由于抗真菌药物的广泛使用，耐药性的出现也限制了患者的成功治愈。现如今，联合用药日益成为一种临床治疗方法，其可以使抗真菌药物的疗效增强、病原菌的耐药性和毒性降低。白色念珠菌中的HDAC具有参与调控细胞生长、毒力因子和耐药性等作用。帕比司他(Panobinostat，Pano)是组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制剂，具有抗肿瘤作用。关于Panobinostat与氟康唑(Fluconazole，FLC)联用对白色念珠菌是否具有活性抗菌作用，有待研究。
目的
探索Pano联合FLC的情况下，对白色念珠菌的体外抗菌活性，对动物模型的体内抗菌作用，并探索Pano与FLC联用时与协同作用可能相关的抗菌机制。
方法
为了评价Pano与FLC联用对白色念珠菌的体外抗菌活性，根据美国临床和实验室标准协会规定的M27-A3文件(CLSI，M27-A3)，采用微量肉汤稀释法测定Pano与FLC单用和联用时对抗白色念珠菌浮游菌的最低抑菌浓度(MIC)，用分数抑制浓度指数(FICI)模型分析药物组合的相互作用;采用XTT比色法测定Pano和FLC对白色念珠菌生物膜的联合抗真菌活性。
为了评价Pano与FLC联用对白色念珠菌的体内抗菌活性，建立了大蜡螟幼虫生物侵染模型。在不同药物组别干预后，测定受感染幼虫的存活率、真菌载菌量和组织病理学研究，以评价Pano与FLC联用在体内的抗真菌效果。
为了探讨Pano与FLC联用的潜在抗真菌机制，在显微镜下观察了药物干预对念珠菌菌丝生长的抑制作用;通过测定Pano对荧光底物罗丹明6G(Rh 6G)吸收和外排的影响，探讨了药物干预对药物转运体的影响;通过荧光探针FITC-VAD-FMK在显微镜下观察了药物干预对白色念珠菌凋亡的影响，进一步阐明Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌的潜在抗菌机制。
结果
(1)Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌浮游细胞表现出协同抗菌作用
当Pano与FLC结合使用时，可以将FLC的MIC值从≥512μg/mL降低到0.25-0.5μg/mL，FICI值为0.0024-0.0166，远小于0.5，表明Pano与FLC联合对耐药白色念珠菌有很强的协同抗菌作用。
(2)Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌生物膜表现出协同抗菌作用
对白色念珠菌4h，8h时形成的生物膜，Pano将FLC的sMIC值从≥512μg/mL降低到0.5-2μg/mL，FICI值为0.0049-0.0635。因此，对于早期的生物膜细胞(≤8h)，Pano联合FLC显示协同作用。而Pano和FLC的组合对12h和24h时形成的生物膜呈无关作用。
(3)Pano与FLC联用在大蜡螟幼虫体内呈现协同抗菌作用
在生存率变化实验中，对照组、Pano单独组和FLC单独组无显著性差异，生存率分别为10％、20％和35％(P＞0.05)，而Pano和FLC联合应用可使生存率提高到80％(P＜0.05)。在真菌载菌量实验中，Pano联合FLC可显著减少大蜡螟幼虫体内白色念珠菌的数量。在组织病理损伤实验中，与其他组相比，联合用药组的菌落数量和面积大大减少，组织损伤明显减少。
(4)Pano与FLC联用可抑制耐药白色念珠菌的菌丝生长
用RPMI-1640培养基诱导白色念珠菌菌丝生长，经药物干预后用显微镜观察。结果显示对照组形成长而交错的菌丝，单药组与对照组相比几乎无明显差异。而联用组中菌丝细胞的数量明显减少，菌丝长度也有变短。结果表明，Pano联合FLC可抑制耐药白色念珠菌菌丝生长。
(5)Pano对耐药白色念珠菌的药物吸收和外排没有影响
与对照组相比，无论对于Rh6G的吸收和外排，Pano药物干预组的结果均无显著性差异(P＞0.05)。可以推断，Pano和FLC联合对药物转运蛋白的调节没有影响。
(6)Pano与FLC联用激活细胞内的metacaspase酶，从而诱导真菌细胞凋亡
Metacaspase酶的激活是细胞凋亡的主要因素，可引起细胞形态学改变和DNA断裂从而导致死亡。FITC-VAD-FMK具有穿透细胞膜并结合metacaspase酶从而产生荧光的能力，可用于观测本试验中metacaspase酶的激活情况。通过倒置荧光显微镜观察，图像显示，Pano+FLC联用组的细胞数量比其他组少，并且显示亮绿色荧光。相反，对照组和药物单用组的细胞数目多且不显示荧光。此外，通过计算荧光细胞数目与总细胞数目的比例，表明联用组中荧光细胞的比例也远高于其他组。结果表明，Pano与FLC联用激活细胞内的metacaspase酶，从而诱导真菌细胞凋亡。
结论
总之，本研究表明Pano与FLC联用对耐药白色念珠菌的浮游细胞和生物膜都有协同抗菌作用。此外，Pano与FLC联用延长了被白色念珠菌感染的大蜡螟幼虫的寿命，并且减轻了幼虫的真菌载菌量和组织损伤。机制研究表明，Pano与FLC联用可以抑制白色念珠菌的菌丝生长，可以激活metacaspase酶从而诱导细胞凋亡。本研究从白色念珠菌的代谢通路以及抗真菌药物潜在靶点出发，探讨可能的药物联合效果，希望这些发现可以为克服真菌耐药提供见解，并且可以有助于新的抗真菌辅助用药的开发。