乳酸菌生物发酵手段可以有效地保藏鱼肉,并能改善鱼肉产品的感官品质和功能特性,因而得到了国内外学者的关注。本实验室之前已开发出了一种风味独特、具有良好凝胶特性的发酵鱼糜制品,并阐明了发酵鱼糜酸诱导凝胶的形成机理和研究了戊糖片球菌蛋白酶对凝胶特性的影响,但鱼肉内源酶对发酵产品凝胶特性和抗氧化特性的影响还没有被系统地研究。鱼肉内源酶含量丰富,它们对产品品质的影响不可忽略,因此本研究在实验室已建立的生物发酵鱼糜技术的基础上,研究了影响发酵鱼糜品质的内源酶的性质,以及它们在发酵过程中对凝胶特性和抗氧化特性的影响。本课题对于进一步了解发酵鱼糜凝胶形成及劣化原因,和了解发酵鱼糜抗氧化活性的变化及其产生原因具有重要的学术意义,同时也为掌握生物发酵鱼糜核心技术、开发高质量的鱼糜制品提供翔实的理论依据,从而为提高我国水产品精深加工技术水平做出贡献。本文首先研究了影响发酵鱼糜品质的与蛋白变化相关的重要内源酶。通过测定不同pH、温度下的内源酶活力,并进行响应面设计和活化能计算,确立了鱼糜内源蛋白酶在发酵区间内的行为模式和动力学参数;通过将肌原纤维蛋白作为底物,确立了内源蛋白酶对发酵区间内鱼肉体系的水解模式;通过非特异性酶活力测定、肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的电泳分析以及氨基态氮含量的测定,比较了植物乳杆菌蛋白酶和内源蛋白酶对蛋白降解的影响;通过对内源酶特异性酶活的测定,电泳分析或键的测定,确立了不同内源酶对鱼肉关键蛋白的作用。结果表明:内源蛋白酶在pH 4.0处总酶活最高,pH 7.0处总酶活最低;发酵条件(25oC–37oC)相比冷藏条件(4oC附近),温度、pH变化对蛋白酶活力影响更为显著,说明对鱼糜制品发酵阶段温度和pH的控制比货架期冷藏阶段的控制更为关键;内源蛋白酶在低pH条件下(pH 4.5和pH 5.0),肌原纤维蛋白倾向于先聚集形成沉淀,再被蛋白酶水解,在其他pH条件下(pH 5.5–pH 7.0),肌原纤维蛋白没有发生聚集沉淀,仅在后期被轻微降解;内源蛋白酶兼具有外肽酶和内肽酶活力;在发酵过程中,溶酶体蛋白酶(组织蛋白酶B、L、D)的活力显著上升,胶原蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶的活力显著下降,且酸性蛋白酶(组织蛋白酶B、L、D)对肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(actin)的降解更为显著;内源TG酶在发酵过程中急剧下降,且在酸性条件下形成ε-(γ-Gln)-Lys键的能力不强,不是影响蛋白交联的关键因素。然后,研究了内源蛋白酶对发酵鱼糜凝胶特性的影响及原因。通过酶抑制剂的特异性选择抑制,确立了影响凝胶强度的关键蛋白酶;通过对水解时间的控制,研究了内源蛋白酶对肌原纤维蛋白不同程度的水解对凝胶强度的影响;通过对不同pH条件下和不同蛋白质聚集状态下TCA-可溶解性肽的测定确定了影响蛋白酶水解蛋白活力的主要因素;通过荧光光谱、紫外光谱、拉曼光谱手段,从分子水平阐明了内源蛋白酶造成凝胶劣化的原因。结果表明:半胱氨酸蛋白酶(组织蛋白酶B、L、H)和天冬氨酸蛋白酶(组织蛋白酶D)是造成凝胶劣化的关键内源蛋白酶,且对凝胶强度的影响主要发生在后期;金属蛋白酶及丝氨酸蛋白酶(钙蛋白酶、胶原蛋白酶等)起次要作用,且这两类内源酶对凝胶的劣化作用发生在发酵初始阶段;内源谷氨酰胺转氨酶对凝胶的作用也集中在发酵初期,且在整个发酵过程中对凝胶特性影响较小。内源蛋白酶对发酵鱼糜凝胶始终起到劣化作用,适度的水解不能增加凝胶强度。蛋白质聚集特性的改变对蛋白酶水解活力的影响较小,pH的下降是造成蛋白酶水解活力改变的主要原因,酸的作用可以激活酶原。内源蛋白酶能切下疏水氨基酸残基,破坏疏水相互作用,是造成凝胶强度下降的原因;内源蛋白酶的作用不会显著影响二硫键的含量,但是会使更多α螺旋结构解旋和β折叠结构减少,形成无规卷曲结构,从结构上解释了凝胶强度下降的原因。最后,研究了内源蛋白酶对发酵鱼糜抗氧化特性的影响及原因。通过测定ABTS清除率、DPPH清除率、金属Fe2+螯合能力确定了发酵过程中抗氧化活力的变化;通过测定发酵过程中水解度、游离氨基酸、分子量分布,分析了影响抗氧化活性的相关因素;通过凝胶Sephadex-15柱层析分离不同分子段的多肽并测定各峰的抗氧化活力,将各组活性成分最高的峰通过液质联用(LC-MS)鉴定,确立了发酵过程中多肽序列及结构的改变对抗氧化活力造成的影响。结果表明:发酵鱼糜的ABTS清除率随着发酵时间的增加而增加,DPPH清除率先上升后下降,这两种抗氧化活力在发酵结束时都趋近于80%,金属Fe2+螯合能力在整个过程中比较低,不超过20%。鱼糜发酵过程中,迅速上升的水解度和三种抗氧化能力的变化趋势没有完全吻合,仅存在一定的相关性;大多数疏水性游离氨基酸在发酵48 h内显著增加,总游离氨基酸含量也在增加;>10000 Da的多肽含量先上升后下降,<5000 Da的多肽先减少后变多,小分子多肽(2000 Da–500 Da)的增长速度在发酵后期显著加快,多肽含量的变化相比游离氨基酸总量的变化与抗氧化活力的改变存在更高的相关性;内源酶水解活力与三种抗氧化能力相关性最高。LC-MS结果显示,在酸和内源酶的作用下,产生了含有苯丙氨酸、酪氨酸的多肽序列,以及含有N-端疏水性氨基酸、C-端亲水性氨基酸的多肽序列,造成了抗氧化性的提高;所有组仅含有少量的谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸基团,可能是造成整个发酵过程Fe2+螯合能力较低的原因。本文确立了影响发酵鱼糜凝胶品质的关键酶是内源组织蛋白酶类,确定了它们在发酵过程中的高活力、热稳定性、酸稳定性、以及对蛋白较强的水解能力,阐明了内源蛋白酶造成凝胶劣化的主要原因是其可以酶切疏水氨基酸基团导致疏水相互作用的下降;并揭示了自由基清除能力的提高是由酸和内源酶共同作用产生大量含有疏水氨基酸的多肽序列导致。