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液泡型H+-ATPase(Vacuolar-typeproton ATPase,简称V-ATPase)在昆虫的生长发育过程中起着重要作用。昆虫中的V-ATPase主要存在于马氏管、中肠、唾液腺等的上皮细胞质膜上,通过耦合K+/2H+反向运输载体将K+或Na+转运至细胞外,推动营养物质的吸收并为各种生命活动提供能量。鳞翅目昆虫中肠杯状细胞顶膜上的V-ATPase通过转运H+为中肠肠腔营造碱性环境,使中肠碱性水解蛋白能够正常发挥作用。本实验克隆了棉铃虫V-ATPase E亚基和G亚基基因开放阅读框序列;并通过荧光定量PCR(Real-time PCR),测定分析了棉铃虫V-ATPase V1结构域亚基在棉铃虫不同发育阶段和不同组织的表达动态及亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对其表达水平的影响。主要研究结果如下:(1)通过特异性引物PCR扩增克隆出编码棉铃虫V-ATPE亚基和G亚基的开放阅读框区域。E亚基开放阅读框序列长681 bp,编码226个氨基酸,预测分子量和等电点分别为26.1 KD和8.30。根据氨基酸序列同源性分析和系统发育树可知,V-ATPase E亚基是一个保守的亚基,氨基酸序列前70位完全保守;与斜纹夜蛾、粉纹夜蛾的同源性分别高达92%、91%。G亚基开放阅读框序列长354bp,编码117个氨基酸,预测分子量和等电点分别为13.7KD和9.40。根据氨基酸序列同源性分析和系统发育树可知,G亚基是一个保守的亚基,氨基酸序列主要在C端(C-termini)存在很少的氨基酸差异;与斜纹夜蛾、家蚕的同源性分别高达96%、95%。(2)棉铃虫在不同发育阶段V-ATPaseV1结构域亚基的基因表达分析结果表明:V-ATPase V1结构域8个亚基在棉铃虫整个发育阶段均有表达,表达量存在差异。A亚基在棉铃虫雌蛾的表达量最高,雄蛹和雌蛹的表达量最低;B亚基在棉铃虫五龄的表达量最高,雄蛹和雌蛹的表达量最低;C亚基在棉铃虫三龄和五龄的表达量最高,雄蛹和雌蛹的表达量最低;D亚基在棉铃虫五龄的表达量最高,雌蛹和雄蛹的表达量最低;E亚基在棉铃虫五龄的表达量最高,雌蛹和雄蛹的表达量最低;F亚基在棉铃虫四龄的表达量最高,雌蛹和卵的表达量最低;G亚基在棉铃虫二龄的表达量最高,卵、雄蛹和雌蛹的表达量最低;H亚基在棉铃虫二龄的表达量最高,卵、雌蛹和雄蛹的表达量最低。(3)棉铃虫不同组织中V-ATPase V1结构域亚基的基因表达分析结果表明:V-ATPase V1结构域8个亚基在棉铃虫不同组织均有表达,表达量存在差异。A亚基在棉铃虫雌蛾和雄蛾头部的表达量最高,雌蛾翅的表达量最低:B亚基在棉铃虫雄蛾触角的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低;C亚基在棉铃虫中肠的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低;D亚基在棉铃虫中肠的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低:E亚基在棉铃虫中肠的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低;F亚基在棉铃虫雌蛾触角的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低;G亚基在棉铃虫中肠的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低;H亚基在棉铃虫雌蛾胸的表达量最高,雌蛾腹节的表达量最低。(4)LD50氯虫苯甲酰胺处理棉铃虫三龄幼虫后,V-ATPase V1结构域各亚基基因表达量分别表现为:A、B和G亚基表达量上升,C、D、E、F和H亚基表达量下降。其中A、B及E亚基对照与处理间有显著性差异。以上结果表明V-ATPase在棉铃虫的生长发育及生殖过程确实扮演着重要的角色,如果能够通过敲除V-ATPase某个亚基基因致使棉铃虫死亡率、畸形率上升或繁殖力下降,那么利用基因编辑技术寻找新的靶基因来防治棉铃虫等鳞翅目害虫不失为一个好的策略。