论文部分内容阅读
目的:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。卵巢癌的治疗策略是以手术联合化学药物治疗为主。但是经过一段时间的化疗后,患者都不可避免地产生化疗耐药现象,同时可能引起90%的患者发生肿瘤转移,导致治疗失败乃至最终死亡。因此,寻找卵巢癌早期诊断及其化疗耐药的分子标志物,研究卵巢癌耐药的分子机制,对指导临床治疗的用药和提高肿瘤患者生存率具有重要的意义。2005年,人们利用基因表达谱芯片,首次发现ERp57参与了卵巢肿瘤的化疗耐药。2009年,人们利用比较蛋白质组学方法,对比了卵巢癌细胞A2780和卵巢癌耐药细胞A2780/TC中的差异表达蛋白,发现了ERp57的是表达差异明显的蛋白中的一个,同时发现ERp57/TUBB3在耐药肿瘤细胞的细胞骨架上形成了复合物。2015年有研究者发现ERp57参与食管癌的放疗抵抗,抑制ERp57-STAT3复合物可以激活Mcl-1,从而恢复食管癌细胞对放疗的敏感性。但是,截至目前为止,ERp57参与的肿瘤耐药的具体机制仍不清楚。为了揭示ERp57与紫杉醇耐药的内在关系,我们以稳定的紫杉醇耐药卵巢癌细胞株SKOV3/tax（耐药细胞株中ERp57蛋白表达上调）和对应的紫杉醇药敏卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象,研究了细胞生物行为学和基因表达以及相关蛋白质表达水平,探讨其耐药机制。此外,我们还利用生物信息学方法分析了ERp57在卵巢癌耐药中可能相互作用通路、相互作用分子以及生物学功能,为卵巢癌耐药临床治疗提供新靶点和新思路。为了解决肿瘤治疗的问题,本论文又探索了利用新型的核酸适配体分子增加耐药肿瘤细胞的药敏性和抑制迁移侵袭的作用。虽然人们试图利用肿瘤耐药和侵袭转移信号转导途径中的关键性分子的抗体或小分子抑制剂来抑制肿瘤的化疗耐药和转移过程,但是成功率甚低,同时其昂贵的价格也不是所有患者都能够负担的。AS1411是一个富含鸟嘌呤的寡核苷酸链,在生理条件下能够形成G-四链体结构。AS1411与肿瘤细胞膜上的核仁素（nucleolin）结合后被肿瘤细胞摄取,然后AS1411再与下游蛋白或其他调控蛋白作用,诱导肿瘤细胞凋亡,发挥其抗肿瘤活性。基于我们的前期实验结果,本论文提出了利用非杀伤剂量的AS1411实现增强耐药肿瘤细胞的药敏性和抑制肿瘤细胞转移的设想。本论文将考察具有不同空间拓扑构象的G-四链体对两对紫杉醇敏感和紫杉醇耐药卵巢癌细胞的生物学作用,探索G-四链体增敏机制和抑制迁移侵袭能力,为化疗耐药的卵巢癌患者选择合理的治疗方案提供实验依据和理论基础。研究方法:1.利用MTT法测定细胞生存率,计算卵巢癌耐药细胞株SKOV3和SKOV3/tax细胞的耐药指数,用Western Blot方法分析了两种细胞中耐药相关分子的表达水平。2.转染ERp57-si RNA后,克隆形成实验检测了降低ERp57表达后细胞集落形成能力,Transwell小室检测了细胞的迁移能力。3.转染ERp57-si RNA后,MTT法检测卵巢癌细胞在紫杉醇作用下细胞存活率,流式细胞计数检测细胞凋亡水平和克隆形成实验检测细胞的集落形成能力。4.利用Western blot检测ERp57干扰前后对耐药相关蛋白P-gp和TUBB3,增殖相关蛋白PCNA和nucleolin,细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Bcl-xl,侵袭转移相关分子MMP1、MMP2、MMP9和vimentin以及STAT3表达的影响。5.利用生物信息学软件STRING构建与ERp57相互作用的蛋白-蛋白相互作用网络,Gene MANIA构建ERp57基因/蛋白-基因/蛋白网络,COREMINE分析ERp57参与卵巢耐药的生物学过程和共同存在的基因,DAVID分析ERp57参与卵巢癌耐药的信号转导通路。6.利用MTT法筛选了对卵巢癌细胞有具有抗肿瘤活性的G-四链体。7.利用CD光谱法分析培养基和模拟细胞生理离子条件下G-四链体的拓扑构象。8.利用Thioflavin T染料染色方法检培养基和模拟细胞生理离子条件下是否形成G-四链体拓扑构象。9.利用克隆形成实验检测G-四链体对卵巢癌敏感细胞和耐药细胞的细胞集落形成的作用,观察卵巢癌敏感细胞和耐药细胞的形态特征。10.长时间和高剂量G-四链体作用卵巢癌细胞,利用Western Blot分析其蛋白表达。11.短时间和低剂量G-四链体作用卵巢癌细胞,利用划痕实验和Transwell小室实验分析水平迁移能力以及垂直迁移和侵袭能力。12.利用Western Blot分析短时间和低剂量G-四链体作用下蛋白表达水平。13.利用Transwell小室实验分析ERp57-si RNA、STAT3-si RNA、nucleolin-si RNA对A2780和A2780/tax细胞迁移和侵袭能力的影响。研究结果:1、卵巢癌耐药细胞株SKOV3的紫杉醇的IC50为3.24±0.03 n M和SKOV3/tax的IC50为101.06±0.99 n M,SKOV3/tax细胞的耐药指数为31.19±0.59。Western Blot检测了两种细胞中耐药相关分子的蛋白表达水平。我们诱导建立的耐药细胞SKOV3/tax较之于亲本细胞SKOV3的蛋白表达,耐药细胞中ERp57表达水平明显增加。同时p-STAT3活化形式表达明显增加。细胞增殖相关分子PCNA耐药细胞中表达下降。紫杉醇耐药标记分子TUBB3,转运蛋白P-gp均增加表达。耐药细胞SKOV3/tax中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达增加,凋亡蛋白Bax表达下降。同时与侵袭转移相关的分子MMP2和MMP9表达均明显下降。EMT相关标记分子vimentin表达无明显变化。2、ERp57-si RNA能明显降低卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/tax的克隆形成能力和迁移能力。3、ERp57-si RNA降低了卵巢癌细胞的克隆形成能力,增加了紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡的能力。ERp57-si RNA增加了耐药细胞对紫杉醇的敏感性。4、ERp57通过抑制了P-gp和TUBB3的表达恢复了对紫杉醇的敏感性,通过降低Bcl-2,Bcl-xl,增加了Bax,p53/p47亚型提高了紫杉醇诱导的细胞凋亡水平,通过抑制p-STAT3,MMP1、MMP2和MMP9的表达抑制了卵巢癌细胞的迁移能力。5、生物信息学软件预测了ERp57参与卵巢癌耐药机制的相互作用蛋白和信号通路。6、筛选了五种寡核苷酸中对卵巢癌耐药细胞和敏感细胞均有治疗作用的G-四链体AS1411。AS1411在培养基和模拟生理的离子条件下形成混合型G-四链体结构。7、利用Thioflavin T染色法观察发现AS1411,38,39,T40214和T40231均能形成G-四链体结构,CRO序列不能形成G-四链体结构。8、AS1411抑制了卵巢癌细胞增殖,卵巢癌在AS1411作用下卵巢癌细胞细胞形态变圆。9、长时间和高剂量的AS1411能够诱导p53或p53/p47亚型的表达增加抑制Bcl-2的表达,增加Bax表达,增加Caspase 3活性形式的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。AS1411能够抑制P-gp、nucleolin和STAT3的表达提高紫杉醇的敏感性。10、短时间和小剂量AS1411通过ERp57/STAT3/MMP9抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。结论:1、肿瘤耐药是一个多因素、多机制、多层次的复杂体系,ERp57为逆转肿瘤耐药提供了靶点。2、AS1411能够增加卵巢癌耐药细胞的紫杉醇敏感性,抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。