慢性粒细胞白血病（chronic myelogeous leukemia, CML）,是以费城染色体（Philadephia, Ph）为特征的多潜能干细胞异常的骨髓恶性增殖性疾病。全世界每年约有10/1,000,000人发病,CML的发病率约占各类白血病的20%。在我国,CML约占各类白血病的15-20%,仅次于急性粒细胞白血病（acute myelogenous leukemia, AML）和淋巴细胞性白血病（acute lymphocyte leukemia, ALL）。目前针对该病的发病特点所研制的伊马替尼（STI571; Gleevec, formerly CGP57148B; signal transduction inhibitor）,因具有独特的作用机制和高效的特异性,而在临床上被广泛应用于CML病人的治疗。但是,随着该药的广泛应用尤其在CML后期,其不良反应及耐药问题相继出现。因此,协同用药成为目前研究治疗CML的一大热点。本研究以p210^Bcr-Abl表达阳性的CML细胞株K562细胞、耐STI571的K562/G01细胞和CML CD34⁺细胞为模型,探讨姜黄素（curcumin, Cur）与STI571体外联合应用抗CML的作用特点及其机制。一、姜黄素抗K562细胞增殖的作用及其机制研究为了探讨Cur对K562细胞增殖和诱导凋亡、p210^Bcr-Abl、蛋白酪氨酸磷酸化（protein tyrosine phosphorylation）及相关信号分子的影响以及研究Cur在K562细胞Bcr-Abl基因被阻断的情况下,诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖的强度与单独Cur比较有何不同,从而进一步探讨Cur对K562细胞作用是否具是多靶点的特点和机制。实验中以表达p210^Bcr-Abl阳性的K562细胞为模型,采用的方法有:（1）用台盼蓝排染法观察Cur对细胞生长抑制的作用;（2）用MTT法检测Cur对细胞增殖抑制率的影响;（3）用集落形成法观察Cur对细胞增殖的影响;（4）用AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率;（5）用RT-PCR方法观察Cur对K562细胞Bcr-Abl mRNA的影响;（6）用Western blot方法观察Cur对K562细胞p210^Bcr-Abl蛋白含量及蛋白酪氨酸磷酸化的影响以及用经全硫代修饰的Bcr-Abl序列的反义核酸（ASODN）封闭K562细胞Bcr-Abl mRNA,观察药物的作用特点和机制。结果显示:（1）Cur抑制K562细胞增殖,呈时间和剂量依赖关系;（2）Cur影响K562细胞的集落形成,呈量效关系;（3）Cur诱导K562细胞凋亡,呈剂量依赖关系;（4）Cur对K562细胞的Bcr-Abl mRNA的影响与对照组没有显著性差别;（5）Cur下调p210^Bcr-Abl蛋白含量、蛋白酪氨酸磷酸化水平,且呈时效和量效关系;Cur下调与细胞增殖和凋亡有关的信号分子Procaspase-3、p-Erk1/2、Hsp90、C-myc的表达及上调细胞色素C（cytochrome, Cyt-C）的表达;（6）Cur和ASODN联合应用可协同诱导K562细胞凋亡、抑制细胞增殖、下调p210^Bcr-Abl蛋白含量及与细胞增殖和凋亡有关的信号分子如NF-КB和伴侣蛋白Hsp90的表达。二、姜黄素与STI571单独或联用抗K562细胞作用及相关机制的研究CML病人使用STI571以后,不少病人对STI571产生耐药性。因此,寻求联合用药成为STI571治疗CML的一个策略。Cur在体外抗K562细胞的作用及其特点提示我们,Cur与STI571联合应用是否具有协同效应。本研究观察Cur与STI571单独或合用对K562细胞的影响及相关机制。研究方法:（1）用台盼蓝排染法观察Cur与STI571对细胞增殖的影响以及在显微镜下直接观察药物的细胞毒作用;（2）用集落形成法观察Cur与STI571对细胞集落形成的影响;（3）用台盼蓝排染法观察Cur与STI571二者序贯给药对细胞增殖的影响;（4）用流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）检测Cur与STI571单独或合用对细胞凋亡的影响（;5）用Western blot方法观察Cur与STI571对p210^Bcr-Abl、蛋白酪氨酸磷酸化及与细胞增殖和凋亡有关的信号分子的影响。结果显示:（1）Cur与STI571协同抗K562细胞增殖,作用24 h的协同指数Q>1.15,48 h为0.85<Q < 1.15;（2）Cur增强STI571抗K562细胞集落的形成（Q > 1.15）;（3）STI571对K562细胞作用24 h后,再给予Cur作用24h,两药联合作用的Q值均大于1.15;而先给予Cur作用24h,再给予STI571作用24 h,Q值均小于1.15;（4）Cur与STI571协同诱导K562细胞的凋亡;（5）Cur协同STI571下调p210^Bcr-Abl和蛋白酪氨酸磷酸化的表达,还可协同下调与细胞增殖和凋亡有关的信号分子如PKC和伴侣蛋白Hsp90的表达。三、姜黄素与STI571单独或合用对耐STI571K562/G01细胞的作用及相关机制的研究Cur体外抗K562细胞作用是否还适用于耐STI571的细胞株呢?如果可以,是否还可协同STI571抗K562/G01细胞的作用?为此,我们以经过长期、低剂量STI571诱导的耐STI571的K562/G01细胞为模型,观察Cur是否能够逆转K562/G01细胞对STI571的耐药作用以及能否增强STI571抗K562/G01细胞的作用及其机制。研究方法:（1）用台盼蓝排染法观察Cur与STI571对细胞生长抑制情况以及在显微镜下直接观察药物的细胞毒作用;（2）用集落形成法观察Cur与STI571联合应用对细胞克隆形成的影响（;3）用FCM方法检测Cur与STI571对细胞凋亡的影响;（4）用Western blot方法观察Cur与STI571对细胞p210^Bcr-Abl蛋白含量及与细胞增殖和凋亡有关的信号分子的影响。结果显示:（1） Cur可抑制K562/G01细胞的增殖,作用24 h IC₅₀为（6.5±0.5）μM;而STI571抑制K562/G01细胞增殖24 h IC₅₀为（10±1.0）μM,耐药倍数为（25.93±3.73）μM;Cur可协同STI571抗K562/G01细胞增殖（Q>1.15）,使STI571的耐药倍数下降;显微镜下观察两药合用后细胞粹片增加,细胞肿胀坏死;（2）STI571（2-16μM）单独对细胞克隆形成没有影响（P>0.5）,而Cur 2.5μM即影响细胞克隆的形成（P<0.05）,并呈量效关系;Cur协同STI571抑制细胞克隆的形成; （3） Cur与STI571协同诱导K562/G01细胞凋亡;（4） Cur与STI571协同下调p210^Bcr-Abl蛋白含量及下游信号分子Procaspase-3和NF-КB的表达。四、姜黄素与STI571单独或合用对人慢性粒细胞白血病CD34⁺细胞的作用及相关机制的研究CML是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性疾病,而CD34抗原是一种表达于造血干/祖细胞的膜表面糖蛋白,具有极强的自我复制和不断的分化更新能力,产生与上一代完全相同的子代细胞并在体内形成新的肿瘤等特点。虽然CD34⁺细胞在CML中只占极少数,但它极有可能是肿瘤发生、复发和转移、耐药形成的根源。我们在病人的知情同意下,利用免疫磁珠（magnetic activated cell sorting, MACS）从CML慢性期的病人骨髓筛选出表达p210^Bcr-Abl的CD34⁺细胞（CML CD34⁺细胞）,并以此为实验细胞模型,研究Cur与STI571对CML CD34⁺细胞增殖、凋亡以及对p210^Bcr-Abl表达的影响。研究方法:（1）用台盼蓝排染法和MTT法观察Cur与STI571对细胞增殖的影响;（2）用FCM检测Cur与STI571对诱导细胞凋亡的影响;（3）FCM检测Cur与STI571对p210^Bcr-Abl表达的影响。结果显示:1、STI571抑制CML CD34⁺细胞的生长增殖,但CML CD34⁺细胞对STI571的敏感性不如K562细胞;2、Cur对CD34⁺细胞的生长抑制作用呈量效和时效关系, 24 h IC₅₀为10μM;3、台盼蓝排染法和MTT法结果均显示,STI571（0.1-0.8μM）与Cur（5-20μM）联合作用,对CML CD34⁺细胞的抑制作用呈单独相加（0.85<Q<1.15）或增强作用（Q>1.15）;4、Cur与STI571联合作用诱导CD34⁺细胞的凋亡和坏死比例分别比二者单用增加; 5、STI571对CML CD34⁺细胞的p210^Bcr-Abl的表达没有显著影响（P>0.05 vs Control）;Cur可下调p210^Bcr-Abl的表达,与STI571联合使用后,p210^Bcr-Abl的表达明显减少。从以上实验结果我们得出如下结论:1、Cur抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能与其下调p210^Bcr-Abl、蛋白酪氨酸磷酸化水平以及抑制下游p-Erk1/2、c-myc等信号分子有关;2、Cur协同STI571抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能与其下调p210^Bcr-Abl、蛋白酪氨酸磷酸化水平以及抑制Hsp90和下游PKC等信号分子有关;3、Cur可逆转K562/G01细胞对STI571的耐药性,并与STI571协同抑制K562/G01细胞增殖和诱导凋亡,其抑制K562/G01细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用可能与其下调p210^Bcr-Abl、蛋白酪氨酸磷酸化水平以及抑制下游Procaspase-3和NF-κB等信号分子有关;4、Cur可抑制来源于CML患者骨髓的CD34⁺细胞的增殖并诱导其凋亡,还可协同STI571下调CML CD34⁺细胞p210^Bcr-Abl表达,进而协同抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。总之,Cur在体外可协同STI571抗K562细胞增殖和促进其凋亡、逆转K562/G01细胞对STI571的耐药性,并对来源于CML患者的CD34⁺细胞增殖抑制和诱导凋亡也有类似的协同作用。Cur抗CML的作用具有良好的开发应用前景。