背景与目的β-地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一。其分子基础是人β-珠蛋白基因（HBB）发生突变所致。到目前为止,在世界上不同种族中已发现200余种β-珠蛋白基因突变。其中,绝大部分是单个碱基替代或者是几个碱基的插入或缺失,仅有少数一部分突变是β-珠蛋白基因的部分或者全部缺失。在中国南方,尤其是在广东省和广西省,β-地中海贫血突变具有很高的人群携带率,β-珠蛋白基因突变类型有将近50种,其中43种是点突变或者小插入或缺失,6种是β-珠蛋白基因的大片段缺失。最近,Huang等在一个台湾人携带者中发现了一种新的β-珠蛋白基因缺失—缺失了1.357 kb,该携带者表现为β0-地中海贫血杂合子的表型,具有高水平的HbA2与显著增高的Hb F水平。通过分子分析,我们在一个中国大陆家庭中发现五个成员携带有该类型缺失。有趣的是,携带该缺失的染色体同时携带有3个γ-珠蛋白基因（ε-Gγ-AGγ-Aγ-ψβ-δ-β-1.357kb）。先证者是连锁等位基因与β+-地中海贫血-28（A→G）突变的复合杂合子,其表现为中间型β-地中海贫血（TI）的表型。通过分析该家系中携带有连锁等位基因的个体,我们探讨了临床／血液学表型与β-珠蛋白基因簇基因型之间关系,主要集中在β-珠蛋白基因簇的分子分析和β-珠蛋白基因mRNA和γ-珠蛋白基因mRNA的定量分析。材料与方法研究对象先证者,是一名11岁的女孩,来自于中国南方广东省西部的云浮地区。先证者长期易疲劳,反复褐色尿,黄疸和脾肿大。既往病史示出生正常,没有异常或延长的新生儿黄疸。8月大时,家人注意到其面色苍白,6岁时,左肋下可以触到脾脏,并发现逐渐变大。8岁时,先证者表现出如下临床和血液学表型而被诊断为中间型β-地中海贫血：轻度黄疸,身材矮小,脾缘在左肋下4.5 cm,但没有前额突出和肝肿大；实验室检查示小细胞低色素贫血,血红蛋白（Hb）9.0g／dL,平均红细胞体积（MCV）65.7 fL,平均红细胞血红蛋白量（MCH）22 pg,红细胞分布宽度（RDW）37.7%。血红蛋白电泳发现Hb A2 2.8%,Hb F 72.3%。肝功能检测发现血浆总胆红素升高达49.9μmol/L（正常范围：6-20）,间接胆红素35.6μmol/L（正常范围：0-14）,直接胆红素14.3μmol/L（正常范围0-7μmol/L）在接下来的3年里,贫血逐渐加重,血红蛋白由9.0 g／dL降低到5.3 g／dL,但先证者的日常生活并没有障碍。11岁的时候,先证者被介绍给我们进行基因检测。体格检查发现身材矮小,轻度上网皮肤黄染,肝脏轻度肿大,脾脏重度重大。在这之间,先证者没有输血史。在获得同意后,我们抽取先证者及其16位家庭成员外周血标本进行此次研究。血液学方法红细胞参数分析（血常规）采用全自动血细胞计数仪进行检测,Hb A, Hb A2和Hb F水平的检测采用HPLC技术完成。用酸洗脱的方法检测Hb F在红细胞中分布,酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于检测Gγ、Aγ、β和α-珠蛋白链的比例。DNA分析基因组DNA的提取采用酚／氯仿方法。Gap-PCR技术和反向点杂交技术分别用于检测中国人常见α-地中海贫血缺失和点突变。11种中国人常见β-地中海贫血突变的分析采用反向点杂交方法。多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术用于检测β-珠蛋白基因大片段缺失。设计跨越缺失（根据MLPA结果的提示）的引物用于Gap-PCR扩增整个β-珠蛋白基因及其侧翼序列（GenBank Accession NG000007.3）。通过对较短片段的测序来确定缺失的精确断裂点。为了鉴定MLPA结果提示存在的γ-珠蛋白基因重排,我们设计一对引物用于扩增和γ-珠蛋白基因三联体有关的AGγ-融合基因,上下游引物分别位于Aγ-珠蛋白基因的上游-499～-475 bp处和Gγ-珠蛋白基因的下游+2191～+2210 bp处。正常样由于引物方向相反而不能扩增出任何片段,但在-Gγ-AGγ-Aγ三联体样本中,引物对可以扩增出特异的对应于AGγ-融合基因的片段。为了鉴别非缺失型HPFH和Gγ-珠蛋白基因-158位的XmnI酶切位点对Hb F升高的影响,我们测序了Gγ-珠蛋白基因和Aγ-珠蛋白基因的启动子。我们依据已有文献用七个酶切位点分析了β-珠蛋白基因簇的单倍型。RNA分析为了评价β-珠蛋白mRNA和γ-珠蛋白mRNA的表达水平,我们设计了实时荧光定量反转录PCR实验,采用基于双标准曲线法的定量分析,我们对该家系的4名连锁等位基因携带者和4名正常人的β-珠蛋白nRNA和γ-珠蛋白mRNA进行了基因表达水平检测。并用两独立样本t检验来分析缺失与三联体组与正常对照组之间平均β-珠蛋白：mRNA相对含量和平均γ-珠蛋白mRNA相对含量的差异。结果血液学分析结果先证者（Ⅲ：1）表现为的中间型地中海贫血表型,具有小细胞低色素贫血（Hb5.3 g/dL, MCV 67.7 fL, MCH 20.9 pg）, Hb A2和Hb F升高分别为5.4%和72.8%,Hb F中Gγ-链的比例为55.1%,并且Hb F在红细胞中呈全细胞分布。另外,其它8个家庭成员（Ⅰ：1,Ⅰ：3,Ⅱ：1,Ⅱ：3,Ⅱ：5,Ⅱ：6,Ⅱ：9和Ⅲ：2）表现为轻型β-地中海贫血的表型且其中4个母方家庭成员（Ⅱ：5,Ⅱ：6,Ⅱ：9和Ⅲ：2）的Hb F水平升高（4.3%～11.3%）及异细胞分布的Hb F,这提示β-缺失遗传自她的母亲。珠蛋白基因簇的分子分析分子分析表明先证者是β+-地中海贫血-28（A→G）突变和β-珠蛋白基因缺失的复合杂合子,-28（A→G）突变遗传自父亲,缺失遗传自母亲。该家庭成员中,4个是-28（A→G）突变的杂合子,4个是p-珠蛋白基因缺失的杂合子。另外,有三个成员携带有α-地中海贫血-α3.7／缺失。MLPA结果图提示先证者、先证者母亲及其他3个母方成员（Ⅲ：1,Ⅱ：6,Ⅰ：3,Ⅱ：9和Ⅲ：2）的基因组DNA样本中同时存在β-珠蛋白基因缺失和γ-珠蛋白基因重排。先证者的父亲及另外3个母方成员（Ⅱ：5,Ⅱ：7,Ⅱ：11和Ⅲ：3）的MLPA结果显示所有的探针信号正常。Gap-PCR扩增后异常片段的测序证实存在1.357 kb的p-珠蛋白基因缺失：从Cap位点上游548 bp到Cap位点下游810 bp。该缺失和Huang等报道的台湾型缺失是同一种缺失类型。利用引物对扩增也证实了在Gγ-基因和Aγ-基因之间AGγ-融合基因的存在,这导致了三体化的γ-珠蛋白基因（Gγ-AGγ-Aγ）。测序该融合基因显示是由Aγ-基因的5’端部分与Gγ-基因的3’端融合而成,编码区域和Gγ-珠蛋白基因-样。Aγ-Gγ融合基因被认为是错配染色体之间的交换产生的,并导致γ-珠蛋白基因三联体的产生：AGγ-融合基因的5’侧翼和3’侧翼分别是一个Gγ-基因和一个Aγ-基因（-Gγ-AGγ-Aγ）单倍型分析显示β-珠蛋白基因1.357 kb缺失和γ-珠蛋白基因三联体均与单倍型“+------”连锁,这证明了在这个中国人家系中β-珠蛋白基因1.357 kb缺失和γ-珠蛋白基因三联体的连锁遗传（ε-Gγ-AGγ-Aγ-ψβ-δ-β-1.357kb）。与-28（A→G）突变连锁的单倍型是“-++-+-+”,同时我们发现--珠蛋白基因-225～-222区域的4bp缺失（AGCA）与该单倍型连锁,但AGγ-基因启动子的相应区域不存在该小缺失。实时定量反转录PCR分析显示缺失和三联体组的β-珠蛋白基因mRNA表达水平显著低于正常对照组（t=4.413,P=0.005）,而γ-珠蛋白基因mRNA表达水平显著高于正常对照组（t=2.281,P=0.031）。讨论我们对来自于中国大陆的一个β-地中海贫血家系的混合突变等位基因（β-珠蛋白基因缺失和-Gγ-AGγ-Aγ三联体）进行了分子分析。该珠蛋白基因缺陷在个台湾人携带者中被首次发现,该携带者有典型的轻型β-地中海贫血表型,β-珠蛋白基因缺失了1.357 kb,根据MLPA分析结果,台湾人携带者可能携带有γ-珠蛋白基因三联体。我们的研究证实了以前的发现并首次鉴定了β-珠蛋白基因1.357 kb缺失与γ-珠蛋白基因三联体连锁遗传。通过Gap-PCR和DNA测序分析,我们进一步确认γ-珠蛋白基因重排形式为-Gγ-AGγ-Aγ三联体,因此该珠蛋白基因簇为ε-Gγ-AGγ-Aγ-ψβ-δ-β-1.357kb。该连锁等位基因的携带者表现出典型的轻型β-地中海贫血表型,但又都表现出Hb F升高（4.3%～11.3%）。比较已发表的资料和我们的研究资料,发现台湾人携带者和我们的携带者具有相似的血液学表型,台湾人携带者也表现为小细胞低色素、Hb F和Hb A2升高（MCV 72.5 fL,MCH 25.2 pg Hb F 8.9%,Hb A26.6%）。高水平的Hb A2、中度增高的Hb F及异细胞分布的Hb F提示排除了非缺失型HPFH及（δβ）0-地中海贫血,这为Aγ-珠蛋白基因和Gγ-珠蛋白基因启动子区测序未见突变所证实。先证者是连锁等位基因与β+-地中海贫血-28（A→G）突变的复合杂合子,其表现为中间型β-地中海贫血的表型。根据病史,先证者具有典型地中海贫血综合征的临床表型并像大多数中间型地中海贫血病人一样在十岁以前不需要输血。但是,在过去的三年里,贫血不断加重,血红蛋白由9.0 g／dL降到5.3 g／dL,并出现重度脾肿大。先证者的中度临床表型可能是由于其独特的基因型所致：β+-地中海贫血-28（A→G）突变可以表达低水平的β-珠蛋白链,而连锁的突变等位基因可以导致Hb F升高。自从11岁以后,先证者表现出严重的临床症状病,需要定期输血。这可能和严重的脾功能亢进有关。四个（-GY-AGγ-Aγ）-β-1.357kb-地中海贫血杂合子的显著升高的Hb F应该主要归因于包括启动子在内的β-珠蛋白基因大片段缺失,该缺失导致γ-珠蛋白基因表达增加。β-珠蛋白基因大片段缺失可以改变染色质结构及γ-珠蛋白基因启动子与LCR、有限的转录因子的竞争作用,在β-珠蛋白基因启动子缺失的情况下,γ-珠蛋白基因可以与LCR更好的作用。另外,与β-珠蛋白基因缺失连锁的γ-珠蛋白基因三联体（-Gγ-AGγ-Aγ）也可能贡献了先证者Hb F的高表达,虽然以前的研究表明携带有改型三联体的成人表现出正常水平的Hb F和Gγ-链比例。和四个杂合子相比,先证者的Gγ-链比例更高（55.1%）,这表明额外的AGγ-融合基因可能有一定程度的表达；这个现象揭示显著增加的γ-链可能有赖于个体的贫血状况。在本研究中,我们没有发现Gγ-基因-158的XmnI位点的作用。这是首次鉴定β-珠蛋白基因缺失与γ-珠蛋白基因三联体连锁遗传；两者的遗传连锁可能是由不同时间发生于同一个染色体上的两个独立事件（非同源重组和不等交换）所致。比对β-珠蛋白基因缺失位点5’、3’端的序列和相应正常序列没有发现有同源性。但在5’断裂点附近发现存在有和非同源重组有关的重复AT序列,因此,可能是非同源重组事件导致了β-珠蛋白基因缺失。-Gγ-AGγ-Aγ三联体可能产生于Aγ-珠蛋白基因-271位点与Gγ-珠蛋白基因136号密码子之间的不等交换。但是,由于两个基因高度同源,很难确定精确地交换位点。对β-珠蛋白基因缺失和γ-珠蛋白基因三联体连锁机制的进一步的研究会有利于阐明人γ-珠蛋白基因的调控机制。