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【背景】原发性肝癌是成年人最常见的恶性肿瘤之一,其中90%-95%为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。尽管肝癌的临床研究已取得较大进展,但由于其术后高复发和高转移率,治疗预后不佳,每年因肝癌死亡人数仍高居我国恶性肿瘤致死的第二位。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染已证实是HCC发生的一个主要危险因素。乙肝病毒X蛋白由HBV-DNA中最短的开放读取框所编码,它在HBV感染和HCC发生中起到了重要的作用,且在多数HCC患者肝组织和血清中有HBxAg和抗-HBx抗体的阳性表达,它也是HBV感染和HCC存在的重要生物标志物。HBx具有催化转录活性,通过作用于线粒体以及其它因素如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)和生存素(survivin)等调节凋亡,并且参与细胞内多种信号转到通路,如PI-3-K-Akt/PKB , Jak-STAT ,RAS-RAF-MAPK瀑式级联信号,并影响细胞周期等。Id蛋白即分化抑制或DNA结合抑制蛋白(Inhibitor of Differentiation and/or DNA binding proteins)是缺少DNA结合结构域的螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)蛋白,是HLH转录因子的显性负性调节分子。已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1～Id4等4位成员。它们可调节多种细胞进程,包括细胞生长、衰老、分化、凋亡和血管生成等。研究表明Id蛋白特别是Id1,可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进展,并可以正向调节肿瘤生长,是肿瘤增殖所必需的关键因子。Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险的有用指标,并且可作为治疗肝癌的靶向分子。【目的】(1)检测Id1和HBx在肝癌组织中的表达情况;(2)分析Id1表达与肝癌临床病理特征以及HBx蛋白表达之间的关系;(3)建立两段不同长度的Id1启动子荧光素酶报告基因载体;(4)检测肝癌HepG2细胞中HBx对Id1启动子活性的影响。【方法】(1)收集西京医院病理科保存的肝癌、肝转移癌、肝脏血管瘤等病例的石蜡包埋标本,切片并收集详细的临床资料;(2)免疫组化方法检测Id1和HBx在肝癌组织和非肝癌肝组织中的表达情况;(3)结合临床资料,统计分析Id1在肝癌标本中表达强度与临床病理特征以及HBx表达的关系。(4)检索Id1启动子序列,设计两段不同长度Id1启动子的上下游引物;(5)以HepG2细胞基因组DNA为模板,克隆Id1启动子序列;(6)将启动子片断克隆入荧光素酶报告基因载体中,构建两段Id1启动子荧光素酶报告基因载体;(7)将测序正确的Id1荧光素酶报告基因载体瞬时转染肝癌HepG2细胞系;(8)检测荧光素酶活性,分析HBx对两段Id1启动子活性的影响。【结果】(1)Id1和HBx在肝癌组织中共表达阳性率为97.9%;(2)肝癌组织中Id1和的Id1和HBx的共表达强度高于非肝癌组织;(3)肝癌分化程度越低,Id1和HBx在肝癌中共表达强度越强;(4)HBV复制活跃组和HBV低复制感染恢复阶段,的Id1和HBx的共表达情况高于无HBV感染或有获得免疫组,但HBV中度复制组和无HBV感染或有获得免疫组差异却无统计学意义;(5)Id1和HBx的表达水平与血清AFP,血清ALT、AST,血清胆红素,血凝PT、APTT、INR和FIB水平,以及与肝癌体积不相关。(6)以肝癌HepG2细胞DNA为模板,克隆出两段长度分别为1096bp的Id1p1和266bp的Id1p2的Id1启动子;(7)经酶切并测序鉴定证实两段载体均包含Id1启动子序列,表明包含不同长短的Id1启动子报告基因载体构建成功;(8)经荧光照度计测定证实Id1p1和Id1p2均较空载体有更高的转录活性,两段均包含核心启动子部分,且Id1p1显示出更高的启动子活性。【结论】(1)肝癌组织中Id1和HBx有共同的表达,且肝癌组织中Id1和HBx表达强度高于非肝癌组织;(2)Id1和HBx的共表达强度与肝癌分化类型高低、HBV复制活力相关;而与血清AFP,血清ALT、AST,血清胆红素,血凝PT、APTT、INR和FIB水平,以及与肝癌体积不相关;(3)本实验成功构建了两段不同长度Id1启动子荧光素酶报告基因载体Id1p1/pGL3和Id1p2/ pGL3;(4)在肝癌HepG2细胞中,与对照载体相比Id1p1和Id1p2均显示较强的转录活性。