论文部分内容阅读
目的:1.观察基于“脾肾气火相关病机”的健脾滋肾泻火方及其拆方对ITP小鼠模型的治疗效果。2.探讨健脾滋肾泻火方及其拆方对ITP小鼠的作用环节。3.阐明健脾滋肾泻火方与Breg相关的作用机理及ITP“脾肾气火相关”病机的科学内涵。方法:1.模型建立采用改良后的抗CD41单克隆抗体被动免疫诱导法。通过第1天注射200ul 68ug/kg浓度、第2天注射200ul 102ug/kg浓度、第3天至第13天以每天注射200ul 136ug/kg浓度的抗小鼠CD41单抗（MWReg30）于Balb/c小鼠腹腔的方式诱导ITP动物模型。2.实验分组及处理干预:（1）空白对照组:PBS腹腔注射+生理盐水灌胃处理;（2）模型对照组:抗CD41抗体腹腔注射+生理盐水灌胃处理;（3）强的松对照组:抗CD41抗体腹腔注射+强的松灌胃处理;（4）中药处理组:（1）健脾益气组:抗CD41抗体腹腔注射+健脾益气方处理;（2）滋养肾阴组:抗CD41抗体腹腔注射+滋肾养阴方处理;（3）清热泻火组:抗CD41抗体腹腔注射+清热泻火方处理;（4）健脾滋肾泻火组:抗CD41抗体腹腔注射+健脾滋肾泻火方处理。持续灌胃给药10天（能够满足实验要求的最长给药时间）。3.造模及给药处理期间动态观察并记录小鼠的一般状态、体重以及小鼠皮肤黏膜出血等情况;同时在模型建立的第0天、第3天以及在药物干预的第10天（给药周期结束）通过小鼠尾静脉取20ul全血进行血小板计数检测与分析;并于模型建立成功后随机取各组小鼠股骨骨髓进行巨核细胞总数以及产板巨核细胞数量观察与记录,进行模型评价以及健脾滋肾泻火方及其拆方治疗ITP动物模型的疗效分析。4.给药结束当天采用颈椎脱臼法处死小鼠后无菌取脾脏,200目无菌滤网研磨,红细胞裂解液裂红后制得脾组织单个核细胞悬液。选择公认的小鼠调节性B细胞（Breg）表型CD1dhiCD19+CD5+B细胞亚群为观察对象,采用流式细胞分析仪进行空白对照组、模型对照组、强的松对照组以及中药各处理组治疗后脾组织内CD1dhiCD19+CD5+Breg细胞占淋巴B细胞比重分析;磁珠分选技术分选出调节性B细胞（Breg）后采用Real-time PCR进行各组间Breg细胞IL-10m RNA表达量分析;将分选后所得包含Breg与不含Breg的脾组织单个核细胞体系分别加入CD3/CD28功能性抗体微珠,共培养72小时后取培养上清,ELISA法进行各组间脾组织单个核细胞体系中Breg细胞存在与不存在条件下培养上清中相关炎性因子IFN-γ、TNF-α分泌量的检测。结果:1.造模期间:（1）体重比较:空白对照组小鼠体重表现为:造模前后体重比较不具有统计学意义（Z=-1.918,P=0.055>0.05）,造模前后体重无差别。模型诱导各组小鼠体重表现为:造模前后体重比较,t=4.097,P=0.0001<0.001,有显著统计学意义,造模后体重较造模前减轻。（2）血小板计数比较:空白对照组造模前后血小板计数比较（Z=-0.757,P=0.449>0.05）无差异;模型诱导各组造模前后血小板计数比较（t=66.871,P=0.0001）有显著差异,造模后血小板计数明显降低（3）一般状态比较:模型诱导各组一般情况较正常对照组差,主要表现为精神状态较差以及活动度减低、毛发脏乱、饮食量下降、皮肤黏膜出血情况多见且难以主动吸收等方面;正常对照组未见明显皮下出血。（4）巨核细胞与产板巨核细胞情况:与正常对照组比较模型诱导各组小鼠骨髓中巨核细胞呈现巨核细胞总数增多,产板巨核减少趋势。2.给药期间:（1）体重比较:与模型对照组比较,空白对照组（P=0.0001）、健脾益气组（P=0.0001）、健脾滋肾泻火组（P=0.0001）以及强的松组（P=0.027）体重均有所增加,且均有P<0.05,差异具有统计学意义;滋养肾阴组（P=0.443）、清热泻火组（P=0.999）与模型对照组比较无统计学差异（P>0.05）。（2）血小板计数比较:空白对照组血小板计数（1046±75.01）高于其余各组（P<0.001）;模型对照组血小板计数（549±75.49）低于清热泻火组（713±54.78）（P<0.001）、健脾滋肾泻火组（735±54.78）（P<0.001）以及强的松组（783±49.00）（P<0.001）;与健脾益气组（605±66.57）、滋养肾阴组（605±66.57）比较无统计学差异（P>0.05）;各处理组比较:强的松组血小板计数高于健脾滋肾泻火组以及清热泻火组（P<0.05）,健脾滋肾泻火组与清热泻火组血小板计数比较无统计学差异（P>0.05）。（3）一般情况比较:模型对照组、滋养肾阴组小鼠表现为精神状态差,反应迟钝,饮食量少以及皮肤黏膜出血且主动愈合时间长等情况;健脾益气组较模型对照组表现为精神状态更佳,毛发更浓密,皮肤黏膜出血情况稍有改善,腹腔注射进针更为顺利等情况;清热泻火组精神状态一般,多见小便清凉,肛门秽浊等情况,皮下出血较固定,新生出血点少见;健脾滋肾泻火组小鼠则表现为较模型对照组腹腔注射部位新生出血点少,精神状态更佳;强的松组小鼠活动度有所增加,反应灵敏,饮食量少量增加,偶有双侧腋下以及胸腹部脓肿,皮下新生出血少见。3.给药后各组小鼠脾组织中Breg细胞占比的变化:（1）空白对照组Berg/B值（1.35±0.33）高于模型对照组（0.60±0.22）,P=0.014差异具有统计学意义（P<0.05）;模型对照组Berg/B值低于强的松组（2.13±0.36）,P=0.0001差异具有显著统计学意义（P<0.001）;低于清热泻火组（1.39±0.39）,P=0.025差异具有统计学意义（P<0.05）;低于健脾滋肾泻火组（1.88±0.59）,P=0.019差异具有统计学意义（P<0.05）;低于滋养肾阴组（1.42±0.27）,P=0.003差异具有显著统计学意义（P<0.001）;与健脾益气组（0.70±0.16）比较P=0.967,两组间Berg/B值无差异（P>0.05）;各处理组比较:强的松组与健脾滋肾泻火组、清热泻火组Berg/B值比较无差异（均有P>0.05）,与滋养肾阴组比较P=0.044差异有统计学意义（P<0.05）,两组Berg/B值不同;清热泻火组、健脾滋肾泻火组以及滋养肾阴组间比较P>0.05,三组间Berg/B值无差异。4.给药后各组小鼠Breg细胞表达IL-10m RNA的变化:（1）空白对照组表达I L-10m RNA值（1.22±0.18）高于模型对照组（0.48±0.06）P=0.001,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）模型对照组Breg表达IL-10m RNA值低于健脾滋肾泻火组（1.34±0.38）P=0.002,差异具有显著统计学意义（P<0.05）;低于清热泻火组（0.86±0.19）P=0.046,差异具有显著统计学意义（P<0.05）;低于强的松组（0.95±0.36）P=0.018,差异具有显著统计学意义（P<0.05）。（3）各处理组比较:健脾滋肾泻火组Breg表达IL-10m RNA值高于强的松组,P=0.042,差异具有统计学意义（P<0.05）;高于清热泻火组,P=0.016,差异具有统计学意义（P<0.05）;清热泻火组与强的松组比较P=0.629（P>0.05）,可以认为两组Bre g表达IL-10m RNA值无差异5.给药后各组小鼠Breg细胞对相关炎性因子IFN-γ的影响:（1）各处理组中包含Breg细胞的脾组织单个核细胞体系培养上清中IFN-γ分泌量比较:（1）空白对照组中IFN-γ的分泌量（3.60±0.87）低于模型对照组（7.01±0.38）,P=0.0001差异具有显著统计学意义（P<0.001）。（2）模型对照组中IFN-γ的分泌量高于清热泻火组（4.04±1.52）（P=0.001）、强的松组（3.81±0.22）（P=0.0001）以及健脾滋肾泻火组（3.19±0.31）（P=0.0001）,均有P<0.001差异具有显著统计学意义。（3）各处理组比较:健脾滋肾泻火组、清热泻火组以及强的松组之间比较均有P>0.05,无统计学差异,可以认为三组间培养上清中IFN-γ分泌量无差异。（2）各组包含Breg的脾组织单个核细胞体系与不包含Breg细胞的单个核细胞体系培养上清中IFN-γ分泌量比较:（1）空白对照组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=3.653,P=0.129）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-5.487,P=0.005,差异有统计学意义（P<0.05）,可以认为空白对照组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-γ分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（2）模型对照组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=0.113,P=0.754）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-2.392,P=0.075,两组含与不含Breg体系内培养上清中IFN-γ分泌量无差异（P>0.05）。（3）清热泻火组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=4.354,P=0.105）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-2.790,P=0.049,差异有统计学意义（P<0.05）,可以认为清热泻火组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-γ分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（4）健脾滋肾泻火组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=1.138,P=0.346）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-3.477,P=0.025差异有统计学意义（P<0.05）,可以认为健脾滋肾泻火组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-γ分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（5）强的松组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=2.381,P=0.198）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-8.947,P=0.001,差异有统计学意义（P<0.05）,可以认为强的松组中含与不含Breg体系内培养上清中I FN-γ分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。6.给药后各组小鼠Breg细胞对相关炎性因子TNF-α的影响:（1）各处理组中包含Breg细胞的脾组织单个核细胞体系培养上清中TNF-α分泌量比较:（1）空白对照组与模型对照组比较P=0.078,两组间TNF-α分泌量无差异（P>0.05）。（2）模型对照组与滋养肾阴组、清热泻火组比较均有P<0.001,差异具有显著统计学意义。（3）滋养肾阴组与清热泻火组比较P=0.414差异无统计学意义（P>0.05）,可以认为两组间TNF-α分泌量无差异。（2）各组包含Breg的脾组织单个核细胞体系与不包含Breg细胞的单个核细胞体系IFN-α分泌量比较:（1）空白对照组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=0.001,P=0.974）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-3.44,P=0.026具有统计学差异（P<0.05）,可以认为空白对照组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（2）模型对照组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=1.357,P=0.309）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-5.901,P=0.004具有统计学差异（P<0.05）,可以认为模型对照组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（3）健脾益气组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=2.1,P=0.221）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-2.13,P=0.1差异无统计学意义（P>0.05）,可以认为健脾益气组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量无差异。（4）滋养肾阴组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=1.359,P=0.308）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-4.985,P=0.008,具有统计学意义（P<0.05）,可以认为滋养肾阴组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（5）清热泻火组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=0.006,P=0.942）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-20.793,P=0.0001,差异具有显著统计学意义（P<0.001）,可以认为清热泻火组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含B reg体系内表达量更高。（6）健脾滋肾泻火组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=4.858,P=0.92）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-2.925,P=0.043,差异具有显著统计学意义（P<0.05）,可以认为健脾滋肾泻火组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。（7）强的松组中含和不含Breg组满足正态分布且方差齐（F=0.879,P=0.401）,两组间采用独立样本t检验,结果提示t=-5.275,P=0.006,差异具有显著统计学意义（P<0.05）,可以认为强的松组中含与不含Breg体系内培养上清中IFN-α分泌量存在差异,且不含Breg体系内表达量更高。结论:1.健脾滋肾泻火方、清热泻火方以及强的松对ITP模型血小板计数的提高方面均有作用,以健脾滋肾泻火方在ITP模型症状改善、预防出血以及血小板计数提升方面作用最佳。2.健脾滋肾泻火方通过提高Breg表达量,改善其免疫调节功能发挥抑制Th1细胞分泌相关炎性因子,调整Th1/Th2平衡,从而对ITP模型起治疗作用。3.ITP“脾肾气火相关病机”理论存在一定的物质基础,推测与Breg数量异常和功能失调有关。