研究背景随着静脉溶栓、经皮冠状动脉脉介入术、冠状动脉旁路移植术在临床的广泛应用,越来越多的医生和科研工作者意识到心肌缺血再灌注损伤的重要性。尽早、持续、充分的开通梗死相关血管,恢复缺血心肌的血液灌注,抢救濒临死亡的心肌是缺血性心脏病、急性心肌梗死最重要的治疗原则。但是,再灌注治疗是把“双刃剑”,在恢复冠脉血流的同时加重组织损伤,出现心功能不全、心律失常、心肌梗死面积扩大等严重现象。因此找到有效的减轻缺血再灌注损伤的方法是非常重要的课题。许多研究发现缺血预适应、药物预适应是抗心肌缺血再灌注损伤有效方法,可以诱导释放内源性活性物质,并通过机体内源性的机制如蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶、线粒体ATP敏感钾通道而发挥保护作用。心肌的缺血再灌注损伤是一个极其复杂的病理生理过程,目前公认的主要致病机制包括：氧化应激损伤、细胞内钙超载、细胞凋亡、细胞能量丧失,中性粒细胞炎症反应激活等。同时缺血再灌注损伤涉及到机体内很多调控机制和信号通路的激活和失活。活性氧在缺血再灌注过程中大量产生,具有很强的化学活性,活跃的电子很容易与细胞的组成物质发生反应,使细胞膜脂质过氧化增强,抑制蛋白质的功能并且破坏核酸及染色体,从而破坏细胞的结构和功能。细胞凋亡是连续性程序化细胞死亡,在整个过程中涉及到一系列特殊基因和蛋白的表达,细胞发生特征性的形态学和生化变化。凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程中发挥着重要的作用。抑制心肌细胞凋亡可明显缩小心肌梗死的面积。磷脂酰肌醇-3激酶和其下游的蛋白激酶B(Akt)通路是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的凋亡、存活,以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能。大量的研究表明,药物预处理可以激活心肌细胞内的P13K／Akt信号通路,存心肌缺血再灌注损伤的保护中起决定性的作用。线粒体ATP敏感钾通道也参与缺血再灌注损伤,线粒体ATP敏感钾通道开放剂可以发挥缺血预处理保护作用,而该通道的抑制剂可以阻断缺血预处理的心肌保护作用。线粒体ATP敏感钾通道存在于线粒体内膜,KATP通道开放调节钾离子活动,维持线粒体容积,减少缺血期细胞钙超载和再灌注期活性氧的大量生成,从而发挥心肌保护作用。原花青素是从葡萄籽中提取的一类多酚化合物,具有极强的抗氧化活性,前期的研究发现原花青素有抗氧化、调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎等作用,但原花青素对心肌缺血再灌注损伤是否有保护作用以及内在的机制尚不明确。本实验通过大鼠缺血再灌注损伤模型和离体乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型,从器官、细胞、分子水平研究原花青素对心肌缺血再灌注损伤的作用和作用机理。第一部分原花青素减轻心肌缺血再灌注损伤的研究目的：通过建立存体大鼠急性心肌缺血再灌注模型,观察原花青素对心脏收缩舒张功能、心肌酶CK-MB和CTnI水平、心肌梗死面积的影响。同时利用PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002,验证PI3K/Akt信号通路是否存心肌缺血再灌注损伤中发挥作用。方法：取雄性SD大鼠随机分为假手术组(SO组)、缺血再灌注组(I／R组)、原花青素组(PC组)、LY294004阻断组(LY294002组)共四组。PC组和LY294002组大鼠进行PC溶液灌胃,每天250mg/kg,共4周。SO组和I／R组的大鼠每天用相同体积的生理盐水灌胃,共4周。末次给药24h内,构建大鼠在体心肌缺血再灌注模型。SO组只开胸置缝线而不结扎,I／R组、PC组和LY294002组动物均开胸手术结扎冠状动脉左前降支30分钟,松开结扎线120min,建立急性心肌缺血再灌注损伤模型。LY294004组于缺血前10mi n颈静脉注射LY294002。分别于左冠状动脉前降支结扎前(To)、心肌缺血30min(T1).再灌注30min(T2)、再灌注1h(T3)、再灌注2h(T4)时测定左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVDEP)、左室内压上升／下降的最大速率(±dp/dkmax)。再灌注2h后测血清肌酸磷酸激酶(CK-MB)、肌钙蛋白I的水半,用伊文思蓝和氯化三苯四唑啉染色法测定心肌梗死面积。结果：1、各组大鼠心脏收缩舒张功能比较：各组大鼠缺血前LVSP、LVEDP、±dp/dtmax的基础值比较,差异无统计学意义。SO组各指标在各个时间点的变化无统计学意义。除SO组外,各组的LVSP、±dp/dtmax均逐渐下降,再灌注2h与缺血前比较有统计学意义(P<0.05)；各组的LVEDP均逐渐升高,再灌注2h与缺血前比较有统计学意义(P<0.05)。与SO组比较,I／R组LVSP、±dp/dtmax降低,有统计学意义(P<0.01)；LVEDP升高,有统计学意义(P<0.01)。与I／R组比较,PC组LVSP、±dp/dtmax升高,有统计学意义(P<0.05)：LVEDP减低,有统计学意义(P<0.05)。与PC组比较,LY294002组LVSP、±dp/max降低,有统计学意义(P<O.05)；LVEDP升高,有统计学意义(P<0.05)。LY294002组与I／R组的指标比较无差异。2、各组血清CK-MB和CTnl的比较：与SO组比较,I／R组CK-MB和CTnl升高,有统计学意义(P<0.01)；与I／R组比较,PC组CK-MB和cTnl降低,有统计学意义(P<0.01)；与PC组比较,LY294002组CK-MB和cTnl升高,有统计学意义(P<0.01)；LY294002组与I／R组比较无统计学意义。3.各组大鼠心肌梗死、缺血范围的比较：与SO组(0)比较,I／R组(38.6±2.7%)心肌梗死面积显著升高,有统计学意义(P<0.01)；与I／R组比较,PC组(15.2±2.2%)心肌梗死面积降低,有统计学意义(P<0.01)；与PC组比较,LY294002组(30.3±2.4%)心肌梗死面积升高,有统计学意义(P<0.01)。LY294002组与I／R组比较无统计学意义。除SO组外,各组心肌缺血面积差异无统计学差异。结论：1、心肌缺血再灌注损伤表现为心脏收缩舒张功能下降、心肌组织严重坏死。2、原花青素对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用,可以改善心脏收缩舒张功能,减少心肌酶水平,减少心肌梗死面积。3、阻断PI3K/Akt信号通路后,原花青素的心脏保护作用消失,原花青素的心肌缺血再灌注保护作用与PI3K/Akt信弓通路激活有关。第二部分PI3K/Akt/GSK-3β和线粒体ATP敏感钾通道在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用机制目的：以原代培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象,建立心肌细胞缺氧／复氧(Anoxia/Reoxygenation,A/R)损伤模型,在细胞水半模拟心肌缺血再灌注损伤,观察原花青素预处理对心肌细胞生存率、活性氧水平、凋亡的影响,探讨原花青素对心肌细胞缺氧复氧损伤的作用机制；同时应用P13K/Akt信号转导通路抑制剂LY294002和线粒体ATP敏感钾通道抑制剂5-羟葵酸,从分子水平阐明PI3K/Akt/GSK-3β通路和线粒体ATP敏感钾通道与原花青素心肌保护作用的关系。方法：实验用SD新生大鼠(1-3d),无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,差速贴壁法纯化制成心肌细胞,以1×106／cm2的细胞密度接种于培养皿。存培养48h后随机分为5组：正常对照组(Control组)；缺氧／复氧组(A／R组)：细胞行缺血3h复氧3h；原花青素预处理+A／R组(PC组)：细胞缺氧前加入100ug/ml原花青素预作用30min,再行缺氧复氧；LY294002+PC+A/R组(LY294002组)：培养基中加入浓度为15umo1/1的LY294002,30min后加原花青素,30min后再行缺氧复氧；；5-HD+PC+A/R组(5-HD组)：培养基中加入浓度为100umol/L的5-HD,30min后加原花青素,30min后再行缺氧复氧。检测以下指标：细胞存活率(MTT法)；细胞核Hoeehst33258染色；心肌细胞的ROS水平；Tunel检测细胞凋亡、流式细胞仪检测心肌细胞捌亡率；Western blot法检测心肌细胞内Caspase-3. Akt、磷酸化Akt、GSK-3β磷酸化GSK-3β的表达水平。结果：1、心肌细胞培养结果倒置显微镜下观察：细胞呈放射状,漩涡状,细胞核呈椭圆形,多数居中,细胞呈片状有节律搏动。2、各处理组心肌细胞存活率A／R组(41.51±3.86%)心肌细胞严重受损,细胞存活率明显降低,与Control组(92.36±3.12%)相比差异有统计学意义(p<0.01)；PC组(75.74±4.69%)与A／R组相比细胞存活率升高,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组(47.52±4.71%)与PC组相比细胞存活率降低,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比,无统计学意义；5-HD组(48.13±4.68%)与PC组相比细胞存活率降低,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比,两者差异无统计学意义；LY294002组、5-HD组相比两者差异无统计学意义。3、Hoechst33258染色观察细胞核的改变：control组细胞核为圆形且荧光强度较弱,缺氧复氧诱导心肌细胞核固缩、核破裂,可见强的蓝色荧光,且不均匀,强蓝染的细胞明显增多。PC组强蓝染的细胞较缺氧复氧组减少。LY294002组、5-HD组细胞的改变同缺氧复氧组相似。4、各处理组心肌细胞的ROS水平A／R组(荧光强度为211.6±38.4)与Control组(27.0±5.6)相比细胞的ROS增加,两者差异有统计学意义(P<0.01)；PC组(80.1±10.3)与A／R组相比细胞的ROS水半减少,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组(167.2±18.3)与PC组相比细胞的ROS水平增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比,两者差异无统计学意义；5-HD组(178.3±22.8)与PC组相比细胞的ROS水平增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；LY294002组、5-HD组相比差异无统计学差异。5、Tunel检测细胞凋亡A／R组(25.3±2.64%)与Control组(3.1±0.65%)相比细胞凋亡指数明显增加,两者差异有统计学意义(P<0.01)；PC组(10.2±1.59%)与A／R组相比细胞凋亡减少,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组(19.6+1.79%)与PC组相比细胞凋亡增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比,无统计学差异：5-HD组(18.1±2.03%)与PC组相比细胞凋亡增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；LY294002组、5-HD组相比细胞凋亡无统计学差异。6、流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡水平应用流式细胞仪进行Annexin V/PI双染色对细胞的凋亡水平进行分析测定。Annexin V+/PI为早期凋亡细胞,位于十字象限的右下方。 A／R组(30.71%±3.82%)与Control组(8.36±1.25%)相比凋亡增加,两者差异有统计学意义(P<0.01)；PC组(13.11±1.36%)与A／R组相比细胞凋亡减少,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组(26.12±2.07%)与PC组相比凋亡明显增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；5-HD组(27.47±2.15%)与PC组相比凋亡增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；LY294002组、5-HD组相比无统计学差异。7、Western blotting分析Caspase-3、t-Akt、p-Akt、t-GSK-3β、p-GSK-3β的表达水平。心肌细胞Caspase-3蛋白表达水平：Caspase-3蛋白表达水平可以反映心肌细胞凋亡的程度,Caspase-3蛋白表达高,则凋亡的心肌细胞多,反之,Caspase-3蛋白表达低,则凋亡的心肌细胞少。A／R组与Control组相比,Caspase-3蛋白表达增加,两者差异有统计学意义(P<0.01)；PC组与A／R组相比Caspase-3蛋白表达减少,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组与PC组相比Caspase-3蛋白增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；5-HD组与PC组相比Caspase-3蛋白增加,两者差异有统计学意义(p<0.01),与A／R组相比无统计学差异；LY294002组、5-HD组相比无统计学差异。心肌细胞t-Akt、p-Akt蛋白水平：A／R组与Control组相比,p-Akt蛋白表达略增加,两者差异无统计学意义；PC组与A／R组相比p-Akt蛋白表达明显增加,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组与PC组相比p-Akt蛋白表达明显减低,两者差异有统计学意义(p<0.01)；5-HD组与LY294002组相比p-Akt蛋白表达升高,有显著性差异(p<0.01),与PC组相比无统计学差异。而t-Akt蛋白表达水平在各组无统计学差异,说明是p-Akt发挥作用。心肌细胞t-GSK-3β、p-GSK-3β的表达水平：A／R组与Control组相比,p-GSK-3β蛋白表达略增加,两者无统计学差异；PC组与A／R组相比p-GSK-3β蛋白表达明显增加,两者差异有统计学意义(p<0.01)；LY294002组与PC组相比p-GSK-3β蛋白表达明显减低,两者差异有统计学意义(p<0.01)；5-HD组与LY294002组相比p-GSK-3β蛋白表达升高,差异有统计学意义(p<0.01),与原花青素组相比无统计学差异。而t-GSK-3β蛋白表达水平在各组无统计学差异,说明是p-GSK-3β发挥作用。结论：1、从细胞水平证明了原花青素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤具有保护作用,表现为提高细胞生存率、减少活性氧水平、减少细胞凋亡。2、加入PI3K阻断剂LY294002后原花青素的保护作用消失,说明细胞内P13K/Ak/GSK-3β信号转导通路参与原花青素预处理心肌缺血再灌注损伤保护作用。3、加入线粒体ATP钾通道抑制剂5-HD后原花青素的保护作用消失,说明线粒体ATP敏感钾通道参与原花青素预处理心肌缺血再灌注损伤保护作用。4、原花青素发挥心肌保护作用需两条通道同时存在且功能正常。