论文部分内容阅读
家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是危害蚕业的主要病原之一,随着家蚕与病毒基因组序列相继测序完成,作为鳞翅目模式昆虫的家蚕,自然也成为研究昆虫与病原感染相互作用的生物模型。为了筛选抗BmCPV病毒的基因和蛋白,前期实验室通过数字基因表达谱(Digital gene expression profiling,DGE)和同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)对家蚕中肠进行分析。结果发现多个激素相关的基因和蛋白在感染BmCPV后出现差异表达。20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)是变态昆虫体内的两大激素,协同调控家蚕的蜕皮与变态。本论文研究激素与病毒之间是否存在互作关系及研究激素调控在家蚕抗病毒过程中发挥的免疫防御机制,主要从三方面展开:(1)家蚕感染BmCPV后血淋巴中激素滴度的测定;(2)筛选家蚕感染BmCPV后激素调控相关的差异表达基因;(3)激素调控相关差异表达基因的功能。实验结果如下:1、家蚕感染BmCPV后血淋巴中激素滴度的检测采用高效液相-紫外(HPLC-UV)联用法,检测家蚕在感染BmCPV后,实验组和对照组血淋巴中20E和JHⅢ的滴度。结果显示对照组血淋巴中的20E平均浓度是1.0916μg/mL,实验组平均浓度是0.3926μg/mL,感染了BmCPV的家蚕血淋巴中20E的浓度约为正常家蚕的1/3,表明BmCPV病毒感染降低了家蚕体内蜕皮激素的浓度,阻碍了蜕皮激素在体内的表达。JHⅢ由于浓度太低,未能检测到。2、家蚕感染BmCPV后激素调控相关基因的筛选与鉴定生物信息学方法筛选激素表达调控过程中的相关差异表达基因和蛋白,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法进一步验证与家蚕感染BmCPV相关的差异表达基因,并预测这些基因通过何种信号途径抵御病原,发挥分子免疫机制。结果发现五龄家蚕经口感染BmCPV后,与对照组相比,实验组中20E合成途径中的基因促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)、Cyp450家族酶、Neverland(Nvd)、3脱氢蜕皮激素-3β-还原酶(3-dehydroecdysone-3β-reductase,3DE-3β-reductase)先下调后上调表达。20E合成途径中的关键基因在家蚕感染BmCPV后初期的下调表达,使家蚕体内20E合成减少,72 hpi家蚕血淋巴中20E的滴度低于正常家蚕。家蚕感染BmCPV中后期,20E合成途径中的PTTH、Cyp315A1、Cyp314A1、Nvd上调表达,代谢途径中基因下调表达,使家蚕体内20E滴度上升,推测参与细胞凋亡发挥抗病毒作用。20E信号通路中基因Ecdysone receptor(EcR-A)、Ultraspicacle(USP)、Broad-complex(Br-C)、Nuclear hormone receptor(E75)的下调表达,阻碍20E的级联反应,使蜕皮时间延迟。JH合成途径以上调表达为主,代谢途径中基因保幼激素酯酶(JH esterase,JHE)、保幼激素环氧水解酶(JH epoxide hydrolase,JHEH)主要下调表达,推测病毒感染过程中JH浓度升高,延长幼虫期,推迟就眠时间。信号通路途径中保幼激素结合蛋白(JH binding protein,JHBP)、Krüppel homolog 1(Kr-h1)总体上调表达。这些激素调控相关基因在BmCPV感染家蚕后差异表达,在家蚕抵御BmCPV的过程中发挥作用,参与了免疫分子调控途径。3、新基因FAMeT-2的鉴定与功能分析FAMeT-2(BGIBMGA002314)是JH合成途径中的关键基因,在家蚕感染BmCPV中后期,无论从mRNA转录还是蛋白质组学方面,FAMeT-2在家蚕中肠都上调表达,因此对FAMeT-2进一步进行研究。通过定量PCR对FAMeT-2基因进行组织差异性分析发现,FAMeT-2在家蚕中肠中高表达。对该基因的生物信息学分析显示有保守结构域DM9,可以特异性识别细菌、真菌等外源微生物,通过Imd信号通路参与先天免疫;构建原核表达载体pET28a-FAMeT-2,IPTG诱导大肠杆菌表达,得到了一个27 kDa的目标蛋白;合成FAMeT-2的siRNA,构建pIZT-FAMeT-2过表达载体,分别转染到家蚕BmN细胞,干扰或过表达FAMeT-2成功后,提取总RNA并反转录为模板,定量PCR检测细胞增殖、凋亡及免疫相关基因的转录情况。RNA干扰FAMeT-2后,细胞增殖相关基因下调表达,免疫通路PGRP-LB上调表达;过表达FAMeT-2后,细胞增殖相关基因上调表达,PGRP-LB下调表达。说明FAMeT-2表达量的变化不仅对细胞的代谢、增殖产生影响;而且可能通过调控PGRP-LB识别并降解肽聚糖,间接参与家蚕的免疫调控过程。综上所述,BmCPV病毒感染影响家蚕体内激素正常合成、代谢,造成激素调控相关基因在转录水平出现差异表达。FAMeT-2在一定程度上可促进细胞增殖;通过PGRP-LB特异性识别降解肽聚糖,在Imd信号通路参与先天免疫,其在BmCPV感染后的上调表达是否参与了家蚕的抗BmCPV防御机制还有待进一步的研究。本研究结果不仅有利于更好地了解病毒感染与宿主激素调控机制之间的关系,也将为深入了解家蚕激素调控相关分子的生物学功能和抗病毒防御机制提供有力依据。