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前列腺癌是一种严重危害老年男性健康的恶性肿瘤，其在我国的发病率也有明显的增高趋势，患者死亡的主要原因多是由于肿瘤细胞的远处转移。Livin基因是新近发现的凋亡抑制蛋白家族成员，可以通过抑制内源性及外源性凋亡途径来使肿瘤细胞获得抵抗凋亡的能力，从而发挥其抗凋亡的作用。Livin基因编码两种剪接异构体，分别称之为Livin-α及Livin-β，既往研究认为两者的组织表达及抗凋亡机制并不完全一致。多数情况下，Livin能够特异性的高表达于肿瘤组织而在正常组织中不表达或仅少量表达。然而，最新的研究表明,调节肿瘤细胞侵袭及转移可能是多个IAPs家族成员的普遍属性，因此Livin基因也有可能直接参与调节肿瘤细胞的侵袭及转移。MicroRNAs（miRNAs）是一类广泛分布的非编码RNAs，其作用机制是通过降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译，可以达到减少靶基因表达的目的，从而起到调节蛋白质转录后修饰的作用。课题组前期对Livin基因的转录后修饰进行了一定的研究，发现miRNA-198可以特异性的下调Livin基因在前列腺癌细胞中的表达。目的1.检测Livin基因在前列腺癌组织中的表达，用以探讨Livin基因的表达与前列腺癌患者的病理分级、临床分期及疾病预后之间的联系。2.探讨Livin基因调节前列腺癌细胞侵袭的作用机制，并进一步研究Livin基因的两个剪接异构体在调节前列腺癌细胞侵袭中的功能差异。3.探讨miRNA-198对前列腺癌细胞增殖、凋亡、化疗敏感性、侵袭的影响并探讨其调节细胞周期的机制。方法1.我们首先对前列腺癌组织标本进行免疫组织化学实验，将43例组织按照患者的病理分级及临床分期进行分组：首先按照Gleason评分系统进行病理分级，2-4分的被记为高分化癌（6例），5-7分的被记为中分化癌（21例），8-10分的被记为低分化癌（16例）；其次按照TNM分期系统进行临床分期，其中非转移性肿瘤（T1-4N0M0）为27例，转移性肿瘤（T1-4N1-2M0或T1-4N0-2M1）为16例，根据免疫组化染色阳性细胞的数量及切片的染色程度来进行免疫组化评分，并对所有患者进行定期随访。2.首先转染siRNA及质粒，使用western blot实验检测LNCaP、PC-3及DU-145细胞系中Livin基因的表达，然后使用transwell实验检测三种肿瘤细胞系的侵袭性变化，紧接着使用MTT实验检测肿瘤细胞的活力变化。此外，为了进一步研究Livin基因调节前列腺癌细胞侵袭的机制，我们使用免疫荧光实验检测NF-κB活性的变化及使用western blot实验寻找Livin基因的下游作用分子。3.首先转染miRNA-198mimic，使用RT-PCR及western blot实验检测Livin基因的表达情况并筛选出miRNA-198mimic的作用浓度，紧接着使用MTT实验、Annexin-V—PI实验、transwell实验等检测miRNA-198mimic转染前后前列腺癌细胞的增殖、凋亡、化疗敏感性、侵袭及细胞周期的变化。结果1. Livin基因在前列腺癌组织中的表达及其临床意义我们对43例前列腺癌组织标本进行免疫组化实验后发现有35例前列腺癌组织标本中可见Livin的表达，且表达主要位于前列腺癌细胞的细胞质内，其阳性表达率为81.4%。此外，我们发现Livin在前列腺癌低分化组的表达要明显高于高分化组，同样的，Livin在前列腺癌中分化组的表达也要高于高分化组，然而将前列腺癌低分化组与中分化组进行比较，发现Livin的表达在这两组中未见差异；此外，Livin在转移性前列腺癌组的表达要明显高于非转移性前列腺癌组。紧接着随访结果显示43例患者中肿瘤复发7例，复发率为16.3%：其中Livin表达阳性组中有7例肿瘤复发，其复发率为20%，Livin表达阴性组中0例肿瘤复发，其复发率为0，统计学分析未见明显差异。2. Livin基因调节前列腺癌细胞侵袭的实验研究我们发现高侵袭性的PC-3细胞系表达Livin-α和Livin-β，而低侵袭性的LNCaP细胞系仅表达Livin-α，分别下调/上调Livin在PC-3/LNCaP细胞系的表达后可以分别抑制PC-3/增加LNCaP细胞系的侵袭能力，相同的实验结果也出现在仅表达Livin-β的高侵袭性DU-145细胞系中。此外，分别下调/上调Livin-α和Livin-β在PC-3/LNCaP细胞系的表达后发现两者均可以调节前列腺癌细胞的侵袭，且调节能力无明显差异。此外，在对调节侵袭机制的研究中发现，分别下调/上调Livin在PC-3/LNCaP细胞系的表达后可以分别抑制/活化NF-κB信号通路并抑制/促进Fibronectin和CXCR4的表达。3. MicroRNA-198mimic抑制Livin基因的表达及其干预前列腺癌细胞凋亡及侵袭的实验研究分别转染miRNA-198mimic至DU-145及PC-3细胞系，通过western blot实验检测DU-145细胞系中Livin的表达并筛选出50nM及150nM作为后续实验的最低作用浓度及最高作用浓度。紧接着后续实验发现转染miRNA-198mimic至DU-145细胞系后可以抑制其增殖、促进其凋亡、增加其凋亡敏感性及抑制其侵袭。此外，将miRNA-198mimic转染至PC-3细胞系后可以降解Livin-α mRNA和Livin-βmRNA，同时使处于PC-3细胞G0/G1期的比例增加，而使处于S期的细胞比例减少，从而达到促进PC-3细胞凋亡的目的。结论1. Livin主要表达于前列腺癌细胞的细胞质内，其表达程度与前列腺癌的病理分级及临床分期有关；此外，Livin阳性表达组患者较Livin阴性表达组患者更容易出现肿瘤复发，即Livin基因的表达程度与肿瘤的复发可能存在相关性。2. Livin基因是通过调节NF-κB信号通路后影响Fibronectin和CXCR4的表达，从而起到直接调节前列腺癌细胞侵袭的作用。此外，Livin的两个剪接异构体均可以独立的调节前列腺癌细胞的侵袭。3. miRNA-198mimic可以抑制前列腺癌细胞的增殖、促进其凋亡、增加其凋亡敏感性及抑制其侵袭，此外，miRNA-198mimic可以通过使前列腺癌细胞停滞于G1/S细胞周期调控点来调节细胞的增殖，且上述作用均具有浓度依赖性，即miRNA-198在前列腺癌细胞系中表现出抑癌作用。