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层粘连蛋白(Laminin,LN)是细胞膜的重要成分,采用LN作为细胞基质培养多能干细胞,可以维持干细胞的自我更新和多能性。LN家族中有15种不同的亚型,每一种亚型由三条肽链(α、β、γ)组成,形成十字架结构的异源三聚体。其中Laminin A5(LAMA5)对于维持多能干细胞的生长有重要作用。本研究旨在检测猪不同组织和细胞中LAMININ的表达情况,研究LN在多能干细胞分化过程中的时空表达特性;通过生物信息学分析和分子克隆,确认猪LAMA5基因的存在和表达变化;发现并分子克隆了与猪多能干细胞特性相关的Laminin B1-a(LAMB1-a)可变剪接体。本研究丰富了对猪多能干细胞培养基质研究的信息,为研究猪干细胞多能性的维持提供了理论依据。本研究获得的主要结果如下:1.LAMININ在猪组织和细胞中的表达谱分析用RT-PCR检测猪不同组织(肝脏、心脏、肺、胃、脑、睾丸、脂肪、颗粒细胞组织)、体细胞(肝细胞、脂肪细胞、猪胎儿成纤维细胞)和多能干细胞(DOX-iPS、PS11、PS23)中LAMININ不同亚型的表达情况。结果表明,不同组织和细胞中LAMININ的表达存在明显差异。通过比对组织来源和细胞来源的样品发现,在细胞中LAMININ的表达特异性更加突出,其中在PEF细胞中LAMININ的表达特征为:LAMA4/5-LAMB1/2-LAMC1/2(即LN-411、LN-421、LN-511和LN-521);在猪iPS细胞中LAMININ的表达特征为:LAMA1/5-LAMB1-a/2-LAMC1(即LN-11a1、LN-121、LN-51a1和LN-521)。2.猪LAMA5的生物学分析和克隆未注释有猪LAMA5基因的序列信息和相关报道。为此我们运用NCBI和UCSC等数据库,分析人、牛和山羊的LAMA5基因序列,预测猪LAMA5基因,以RPS21和CABLES2基因对猪基因组数据库(Sscrofa11.1)中LAMA5的可能序列区域进行定位。通过DNAMAN(V6)软件进行比对,确认了猪LAMA5的序列,并设计特异性引物,从猪肺组织样c DNA中克隆了长度为731 bp的猪LAMA5基因序列。测序结果与人和牛LAMA5序列高度一致,序列上传至GENBANK,获得登录号:KY622023。3.猪多能干细胞中LAMININ的表达特性和LAMB1-a可变剪接体的发现通过检测,发现猪iPS细胞中,LAMB1出现了两条特异性条带,为了进一步研究LAMB1的性质,对克隆的两条特异性条带(LAMB1 505bp、LAMB1-a 639bp)进行测序,结果显示与NCBI中已有的LAMB1-X1和LAMB1-X2序列不一样,发现LAMB1-a是一个新的可变剪接体。为了进一步探讨LAMB1与多能干细胞的相关性,选取猪PEF和猪多能干细胞DOX-iPS及分化的iPS细胞进行了检测。结果显示,随着多能干细胞形态的改变,细胞团形态逐渐消失,LAMB1-a的表达逐渐下降,当再次运用DOX-iPS培养基培养后,当细胞团形态再次恢复的时候,LAMB1-a的表达逐渐恢复。在检测中还发现,在iPS重编程过程中LAMA4的表达随着细胞的分化程度,其表达量明显升高,相反在细胞分化的过程中LAMA1的表达量逐渐降低。总之,本研究确定了猪多能干细胞中LAMININ的表达特征,即LN11a1/LN121和LN51a1/LN521;确认了猪LAMA5基因的存在,并分析和克隆了该基因;发现了LAMB1-a可变剪接体,并验证了该基因与多能干细胞的对应关系。